Virusinfektioiden PCR. PCR-diagnostiikka - infektioiden analyysi

Mikä on PCR-analyysi? Tämä on tehokas molekyylibiologian menetelmä, jota käytetään yhdessä perinteisten immunologisten, morfologisten ja biokemiallisten tutkimusten kanssa. Tartuntataudit kehittyvät ja kehittyvät, kuten ihmiskunta itse. Joka vuosi niitä on enemmän ja enemmän, ja niiden diagnosointi on yhä vaikeampaa. Tekijät, jotka provosoivat sairauksien ilmaantumista ja vaikuttavat niiden kehitykseen, sopeutuvat vähitellen myös ympäröiviin ulkoisiin olosuhteisiin ja muuttuvat niiden mukana. Tästä syystä lääketieteessä alkoi ilmaantua uusia menetelmiä ja tekniikoita, jotka auttavat saamaan tarkempia tuloksia tietyn sairauden diagnosoinnissa.

Tällainen tartuntatautien laboratoriodiagnoosin tekniikka perustuu infektion aiheuttajan havaitsemiseen, jota lääkäri epäilee tutkimusaineistossa. Polymeraasiketjureaktio tunnistaa ne tunnistamalla sopivan geneettisen materiaalin (RNA tai DNA) potilaalta otetuista näytteistä.

Amerikkalainen tiedemies Carey Mullis keksi PCR:n vuonna 1983.

Useimmat infektiot reagoivat hyvin hoitoon, jos ne havaitaan ajoissa. Siksi PCR-menetelmä on niin tehokas, koska se pystyy havaitsemaan jopa virukset tai bakteerit, joiden solut ovat yksittäisiä materiaalissa. Lisäksi tällainen diagnoosi määrittää viruksen, määrittää sen ulkonäön luonteen, voiman, jolla se vaikuttaa kehoon, jopa mikrobien määrän potilaan kehossa. Lääkäri voi käyttää kaikkia polymeraasiketjureaktiomenetelmällä saatuja tietoja sopivien lääkkeiden valitsemiseen ja asianmukaisen hoidon määräämiseen.

PCR-tutkimus

Työperiaatteen mukaan kaikki tapahtuu yksinkertaisesti. Potilaalta otettu biologinen materiaali sijoitetaan erityiseen reaktoriin. Sitten lisätään sellaisia ​​spesifisiä entsyymejä, jotka voivat sitoutua materiaalissa olevan mikrobin DNA:han ja syntetisoida sen kopion.

Kopiointi perustuu ketjureaktion periaatteeseen. Eli koko prosessin suorittaminen vie useita vaiheita. Ensin 1 DNA-molekyyli muodostaa 2 uutta molekyyliä, sitten niistä muodostuu 4 uutta ja niin edelleen satoihin ja tuhansiin kopioihin asti. Sen jälkeen suoritetaan analyysi ja sen dekoodaus.

Mikrobin DNA:n fragmentteja voi sisältyä erilaisiin biologisiin materiaaleihin:

• biologisissa nesteissä (sylki, nivel, lapsivesi, pleura, aivo-selkäydinneste, eturauhasen mehu);
• veressä ja sen seerumissa, plasmassa;
• epiteelisolujen kaapimisessa (raapiminen kohdunkaulan kanavasta, virtsaputkesta - sekä naisille että miehille);
• virtsassa (analyysi vaatii aamuvirtsan, nimittäin sen ensimmäisen annoksen);
• ysköksessä;
• limassa ja muissa biologisissa eritteissä;
• mahalaukun ja pohjukaissuolen biopaateissa.

Mitä sairauksia voidaan havaita PCR-menetelmällä?

Lääkärit pitävät tällaista diagnoosia yhtenä tarkimmista. Tämän tutkimuksen avulla voit havaita lähes kaikki lääketieteen tällä hetkellä tuntemat virustaudit. Erittäin tärkeä näkökohta on se, että niiden joukossa on infektioita, jotka elävät ihmiskehossa useita vuosia, mutta eivät ilmene millään tavalla. Ne vain kasvavat odottaen, milloin heidän on mukavinta ilmaista itseään (heikentynyt immuniteetti, kehon ehtyminen jne.). Tällaisten piilevien infektioiden tunnistaminen on erityisen tärkeää urologisilla ja gynekologisilla alueilla.

Tässä on joitain sairauksia, joita analysoidaan usein polymeraasiketjureaktiomenetelmällä:

• hepatiitti B ja C;
• monet sukupuoliteitse tarttuvat sairaudet (klamydiadiagnoosi, ureaplasmoosi, mykoplasmoosi, sukuelinten kandidiaasi, bakteerivaginoosi, trikomoniaasi, tarttuva mononukleoosi, ihmisen papilloomavirusinfektio (HPV), AIDS jne.);
• herpesinfektio (mukaan lukien sukuelinten herpes);
• tuberkuloosi ja helikobakterioosi.

PCR-menetelmä antaa hyviä tuloksia, koska useimmille näistä sairauksista on ominaista se, että niiden oireet (etenkin varhaisessa vaiheessa) eivät ole kovin havaittavissa. Mutta seuraukset, joita niillä on kehoon, ovat erittäin kielteisiä ja usein erittäin vaarallisia terveydelle ja jopa elämälle.

Esimerkiksi sukupuolitaudit voivat lisätä merkittävästi naisten kohdunkaulansyövän mahdollisuutta, vaikuttaa negatiivisesti raskauden kulumiseen tai aiheuttaa hedelmättömyyttä. Lisäksi hänen syntymättömän vauvansa terveys riippuu äidin terveydestä. Siksi pienimmässäkin epäilyssä piileviä infektioita on erittäin tärkeää luovuttaa verta diagnoosia varten ajoissa, jotta estetään sikiön tartunta taudinaiheuttajien tunkeutumisen kautta. Miehille seuraukset eivät ole yhtä kielteisiä: siittiöiden liikkuvuuden ja elinkelpoisuuden väheneminen, miesten hedelmättömyyden ja eturauhastulehduksen kehittyminen, virtsaputken vauriot ja niin edelleen.

Tällainen analyysi on myös erittäin tärkeä virushepatiitin, tuberkuloosin ja erilaisten suolistoinfektioiden oikea-aikaisen havaitsemisen kannalta. Kun tarvitaan välitöntä hoitoa, on erittäin tärkeää ymmärtää, millainen taudinaiheuttaja osui kehoon ja mitä vastaan ​​taistella. Potilaan veri tai mikä tahansa muu biologinen materiaali auttaa suorittamaan täydellisen ja oikean diagnoosin ja määräämään hoidon, joka edistää kehon toimintojen nopeaa palautumista ja edistää toipumista.

Herpes on myös erittäin vastustuskykyinen ja vaarallinen. Ei-aktiivisesta tilasta se voi helposti muuttua progressiiviseksi, joka vaikuttaa keskushermostoon ja vaikuttaa tällaisten kauheiden sairauksien, kuten aivokalvontulehduksen ja enkefaliitin, puhkeamiseen ja kehittymiseen.

Analyysin dekoodaus

Tutkimuksen tekemisen jälkeen voit saada joko positiivisen tai negatiivisen tuloksen. Positiiviset tulokset osoittavat, että kehossasi on tämä tai toinen infektio. Negatiivinen tulos tulkitaan niin, ettei potilaan kehossa ole epäiltyä infektiota. Eli tutkimukseen lähetetystä biologisesta materiaalista ei löytynyt mitään.

Lääkärin tulee tulkita kaikki indikaattorit ja ilmaista ne. Älä lannistu tai pelästy huonoista tuloksista, koska reaktio paljasti taudin, mikä tarkoittaa, että lisätutkimusten jälkeen lääkäri voi määrätä täyden hoidon. Tärkeintä ei ole itsehoitoa eikä viivyttää prosessia.

Analyyseihin valmistautuminen: mitä sinun tulee tietää?

Erilaisten sairauksien havaitsemiseen tarvitaan erilaisia ​​biologisia materiaaleja. Ennen kuin teet PCR:n, muista neuvotella asianmukaisen asiantuntijan kanssa ja valmistautua huolellisesti tulevaan toimenpiteeseen.

Tätä varten sinun on noudatettava tiukasti kaikkia lääkärisi suosituksia ja ohjeita. Muista, että veri otetaan yleensä tyhjään vatsaan. Ottaaksesi kokeen emättimestä tai virtsaputkesta, sinun on pidättäydyttävä yhdynnästä 1-2 päivän ajan, suoritettava kaikki tarvittava sukuelinten hygienia illalla ja huuhdeltava aamulla vain lämpimällä vedellä. On myös tärkeää lopettaa lääkkeiden käyttö noin viikkoa etukäteen, jos niistä ei ole keskusteltu lääkärisi kanssa. Ja 2-3 tuntia ennen testin ottamista, älä virtsaa. Naisten kohdalla kannattaa ottaa huomioon, että optimaalinen aika tutkimuksen suorittamiselle on muutama päivä ennen kuukautisia tai välittömästi sen jälkeen.

PCR-menetelmä: tärkeimmät edut ja haitat

Tämäntyyppisellä diagnoosilla on monia etuja.

Ensinnäkin tartuntatautien aiheuttajat määritetään suorilla ohjeilla, toisin kuin muut perinteiset laboratoriotutkimukset.

Toiseksi tämä analyysi on yksinkertaisesti universaali, koska sitä varten on saatavilla melkein mitä tahansa biologista materiaalia, jota ei useinkaan voida hyväksyä millekään muulle tutkimusmenetelmälle.

On erittäin tärkeää, että kun tämä diagnoosi suoritetaan, tutkittavasta materiaalista eristetään DNA-fragmentti, joka on luontainen vain tietylle patogeenille, toisin sanoen puhtaasti spesifiselle virukselle tai bakteereille. Tämä osoittaa, kuinka spesifinen tämä reaktio on.

Toinen argumentti tämän diagnostiikan puolesta on sen nopea suoritus. Jos viljelytutkimukset eivät vaadi päiviä, vaan jopa viikkoja taudinaiheuttajan eristämiseen ja kasvattamiseen soluviljelmässä, tämä menetelmä antaa tulokset 4-5 tunnin sisällä.

PCR mahdollistaa paitsi jo taudin huipulla olevan infektion, myös kroonisten sairauksien, yksittäisten viruksien tai bakteerien havaitsemisen. Tällainen diagnoosi on mahdollista menetelmän erittäin korkean herkkyyden vuoksi. Tähän tulee sisältyä se, että infektio havaitaan, vaikka analyysiin lähetetyssä biologisessa materiaalissa olisi vain yksi solu tietystä viruksesta tai bakteerista.

Väärät negatiiviset tulokset ovat erittäin harvinaisia.

Totta, menetelmällä on myös haittapuolensa. Yksi niistä on mahdollisuus saada väärä positiivinen tulos. Tämä johtuu usein siitä, että infektio on jo tapettu, mutta sen epiteelisoluja ei ole vielä uusittu, joten reaktio näkee edelleen kuolleet jäännöksensä ja kloonaa sen. Siksi sinun tulee joko odottaa, kunnes infektion kuolleet solut ovat kokonaan poistuneet kehosta (kuukaudesta kahteen hoidon jälkeen), tai käyttää muita menetelmiä varhaisessa vaiheessa: rokotusta tai viljelyä. Myöhemmin on mahdollista suorittaa kontrolli PCR:llä.

Analyysin toisena heikkoutena pidetään kaikkien mikro-organismien vaihtelua. Tämä tarkoittaa, että jotkut patogeenien genotyypit, jotka ovat jo mutatoituneet kehossa, jäävät testausjärjestelmälle käsittämättömiksi, eikä mitään reaktiota tapahdu. Tätä varten tämän menetelmän parantamiseksi tehdään erilaisia ​​​​kehityksiä.

Liittovaltion koulutusvirasto

Valtion oppilaitos

Korkeampi ammatillinen koulutus

"Karjalan valtion pedagoginen akatemia"

Kurssityö aiheesta:

Polymeraasiketjureaktio (PCR) ja sen sovellukset

Suorittanut: opiskelija Koryagina Valeria Aleksandrovna

Tarkastettu: Karpikova Natalia Mikhailovna

Petroskoi 2013

Johdanto

Luku 1. Kirjallisuuskatsaus

1.5.4 "Plateau"-efekti

1.5.6 Vahvistus

Johtopäätös

Johdanto

Viimeiset 20 vuotta ovat olleet molekyyligeneettisten menetelmien laajamittaista käyttöönottoa biologiassa, lääketieteessä ja maataloustieteissä.

1970-luvun alkuun mennessä molekyylibiologia näytti saavuttaneen tietyn valmistumisasteen. Tänä aikana molekyyligeneettisen tutkimuksen pääkohde oli mikro-organismit. Eukaryooteihin siirtyminen aiheutti tutkijoille täysin uusia ongelmia, joita ei voitu ratkaista tuolloin olemassa olevilla geneettisen analyysin menetelmillä. Läpimurto molekyyligenetiikan kehityksessä tuli mahdolliseksi uuden kokeellisen työkalun - restriktioendonukleaasien - syntymisen ansiosta. Seuraavina vuosina laadullisesti erilaisiin lähestymistapoihin perustuvien suorien DNA-analyysimenetelmien määrä alkoi kasvaa nopeasti.

Nykyaikaiset teknologiat ovat monissa tapauksissa mahdollistaneet eri organismien ydin- ja ydingenomien hienon rakenteellisen ja toiminnallisen organisaation tutkimuksen aloittamisen syvemmällä tasolla. Tämä oli erityisen tärkeää uusien menetelmien kehittämisessä eri sairauksien diagnosointiin ja hoitoon. Yhtä tärkeää oli mahdollisuus käyttää molekyyligenetiikan saavutuksia populaatiobiologiassa ja jalostuksessa populaatioiden, lajikkeiden ja kantojen geneettisen vaihtelevuuden tunnistamiseen ja analysointiin, taloudellisesti arvokkaiden yksilöiden tunnistamiseen ja sertifioimiseen, muuntogeenisten organismien luomiseen ja muiden ongelmien ratkaisemiseen.

Jokaisella menetelmällä on omat etunsa ja haittansa. Ei ole olemassa yhtä ainoaa menetelmää, joka voisi ratkaista kaikki esiin tulevat ongelmat. Siksi tietyn menetelmän valinta suoritettavaa tutkimusta varten on yksi tieteellisen työn tärkeimmistä vaiheista.

Luku 1. Kirjallisuuskatsaus

1.1 Polymeraasiketjureaktion (PCR) löydön historia

Vuonna 1983 K.B. Mullis ym. Julkaisivat ja patentoivat polymeraasiketjureaktiomenetelmän (PCR), jolla oli tarkoitus olla syvällinen vaikutus kaikkiin nukleiinihappojen tutkimuksen ja sovellusten alueisiin. Tämän menetelmän merkitys molekyylibiologialle ja genetiikalle osoittautui niin suureksi ja ilmeiseksi, että seitsemän vuotta myöhemmin kirjailijalle myönnettiin kemian Nobelin palkinto.

Menetelmän käytön alussa, jokaisen kuumennus-jäähdytyssyklin jälkeen, oli tarpeen lisätä DNA-polymeraasia reaktioseokseen, koska se inaktivoitui korkeassa lämpötilassa, joka vaadittiin erottamaan DNA-kierteen säikeet. Reaktiomenettely oli suhteellisen tehoton ja vaati paljon aikaa ja entsyymiä. Vuonna 1986 polymeraasiketjureaktiomenetelmää parannettiin merkittävästi. Ehdotettiin termofiilisten bakteerien DNA-polymeraasien käyttöä. Nämä entsyymit osoittautuivat termisesti stabiileiksi ja kestivät useita reaktiojaksoja. Niiden käyttö mahdollisti PCR:n yksinkertaistamisen ja automatisoinnin. Yksi ensimmäisistä lämpöstabiileista DNA-polymeraaseista eristettiin bakteereista Thermus aquaticusja nimetty Taq-polymeraasi.

Mahdollisuus monistaa mitä tahansa DNA-segmenttiä, jonka nukleotidisekvenssi tunnetaan, ja saada se PCR:n päätyttyä homogeenisessa muodossa ja preparatiivisena määränä tekee PCR:stä vaihtoehtoisen menetelmän lyhyiden DNA-fragmenttien molekyylikloonaamiseen. Samaan aikaan ei ole tarvetta käyttää monimutkaisia ​​metodologisia tekniikoita, joita käytetään geenitekniikassa perinteisessä kloonauksessa. PCR-menetelmän kehitys on laajalti laajentanut molekyyligenetiikan ja erityisesti geenitekniikan metodologisia mahdollisuuksia ja niin paljon, että se on radikaalisti muuttanut ja vahvistanut monien alueidensa tieteellistä potentiaalia.

1.2 Polymeraasiketjureaktion (PCR) lajikkeet

· Sisäkkäinen PCR- käytetään vähentämään reaktion sivutuotteiden määrää. Käytetään kahta paria alukkeita ja suoritetaan kaksi peräkkäistä reaktiota. Toinen alukepari monistaa DNA-osan ensimmäisen reaktion tuotteessa.

· Käänteinen PCR- käytetään, jos tunnetaan vain pieni alue vaaditusta sekvenssistä. Tämä menetelmä on erityisen hyödyllinen, kun on tarpeen määrittää vierekkäiset sekvenssit DNA:n genomiin lisäämisen jälkeen. Käänteisen PCR:n suorittamiseksi suoritetaan sarja DNA-leikkauksia restriktioendonukleaaseilla<#"justify">polymeraasiketjureaktioaluke

· Ryhmäspesifinen PCR- PCR sukulaisille<#"center">1.3 Polymeraasiketjureaktio

1980-luvun puolivälissä löydetty polymeraasiketjureaktio (PCR) pystyy lisäämään alkuperäisen näytteen kopiomäärää miljoonia kertoja useiden tuntien aikana. Jokaisen reaktiosyklin aikana alkuperäisestä molekyylistä muodostuu kaksi kopiota. Jokainen syntetisoiduista DNA-kopioista voi toimia templaattina uusien DNA-kopioiden synteesille seuraavassa syklissä. Siten jaksojen useat toistot lisäävät kopioiden määrää eksponentiaalisesti. Laskelmista seuraa, että jopa 30 syklillä alkuperäisen molekyylin kopioiden määrä on yli 1 miljardi. Vaikka otettaisiin huomioon, että kaikki amplikonit eivät monistu jokaisen syklin aikana, kopioiden kokonaismäärä on tästä huolimatta melko suuri luku.

Jokainen polymeraasiketjureaktion (PCR) sykli koostuu seuraavista vaiheista:

· Denaturaatio - Lämpötilan nousu aiheuttaa kaksijuosteisen DNA-molekyylin purkamisen ja halkeamisen kahdeksi yksijuosteiseksi;

· Hehkutus - Lämpötilan alentaminen mahdollistaa alukkeiden kiinnittymisen DNA-molekyylin komplementaarisiin alueisiin;

· Pidentyminen – DNA-polymeraasientsyymi täydentää komplementaarisen juosteen.

Valitun fragmentin monistamiseksi käytetään kahta oligonukleotidialuketta (aluketta), jotka reunustavat spesifistä DNA-aluetta. Pohjustettu 3 - päättyy toisiaan kohti ja vahvistettavaa sekvenssiä kohti. DNA-polymeraasi suorittaa toisiaan täydentävien DNA-säikeiden synteesin (pidennyksen) alkaen alukkeista. DNA-synteesin aikana alukkeet liitetään fyysisesti vastasyntetisoitujen DNA-molekyylien ketjuun. Jokainen DNA-molekyylin juoste, joka on muodostettu yhdellä alukkeista, voi toimia templaattina komplementaarisen DNA-juosteen synteesille toista aluketta käyttämällä.

1.4 Polymeraasiketjureaktion (PCR) suorittaminen

Polymeraasiketjureaktio suoritetaan erityisissä ohutseinämäisissä polypropeeniputkissa, jotka ovat kooltaan yhteensopivat käytetyn lämpösyklilaitteen (vahvistimen) kanssa - laitteen, joka ohjaa polymeraasiketjureaktion (PCR) vaiheiden lämpötilaa ja aikaominaisuuksia.

1.5 Polymeraasiketjureaktiomenetelmän periaate

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on in vitro DNA:n monistusmenetelmä, jolla tietty DNA-sekvenssi voidaan eristää ja kertoa miljardeja kertoja muutamassa tunnissa. Mahdollisuus saada valtava määrä kopioita yhdestä tiukasti määritellystä genomin alueesta yksinkertaistaa huomattavasti saatavilla olevan DNA-näytteen tutkimista.

Polymeraasiketjureaktion suorittamiseksi on täytyttävä useita ehtoja:

1.5.1 Useiden komponenttien läsnäolo reaktioseoksessa

Reaktioseoksen (PCR) pääkomponentit ovat: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nukleotiditrifosfaattien (ATP, GTP, CTP, TTF), alukkeiden (oligonukleotidien) seos, analysoidun DNA:n valmiste, lämpöstabiili DNA-polymeraasi. Jokainen reaktioseoksen komponenteista on suoraan osallisena polymeraasiketjureaktiossa (PCR), ja reagenssien pitoisuus vaikuttaa suoraan monistumisen kulkuun.

· Tris-HCl - määrittää reaktioseoksen pH:n, luo puskurikapasiteetin. DNA-polymeraasin aktiivisuus riippuu väliaineen pH:sta, joten pH-arvo vaikuttaa suoraan polymeraasiketjureaktion etenemiseen. Tyypillisesti pH on välillä 8-9,5. Korkea pH-arvo on otettu siitä syystä, että lämpötilan noustessa Tril-HCl-puskurin pH laskee.

· KCl - kaliumkloridin pitoisuus jopa 50 mM vaikuttaa denaturaatio- ja pariutumisprosessien kulumiseen, yli 50 mM pitoisuus estää DNA-polymeraasia.

· MgCl 2- koska DNA-polymeraasi on Mg 2+- riippuvainen entsyymi, magnesiumionien pitoisuus vaikuttaa entsyymin aktiivisuuteen (Mg 2+muodostaa komplekseja NTF:n kanssa - nämä kompleksit ovat polymeraasin substraatti). Suuri pitoisuus johtaa epäspesifisen monistumisen lisääntymiseen ja pieni pitoisuus johtaa reaktion estoon, optimi (eri polymeraaseille) on alueella 0,5 - 5 mM. Lisäksi magnesiumsuolojen pitoisuus vaikuttaa denaturaatio- ja hehkutusprosessien kulumiseen - Mg-pitoisuuden nousu 2+aiheuttaa DNA:n sulamislämpötilan nousun (eli lämpötila, kuoren kanssa 50 % kaksijuosteisista DNA-säikeistä erotetaan yksijuosteisiksi).

· NTF - nukleotiditrifosfaatit ovat nukleiinihappojen suoria monomeerejä. Kaikkia neljää nukleotiditrifosfaattia suositellaan käytettäväksi yhtä suuressa osuudessa ketjun päättymisen estämiseksi. Näiden komponenttien alhainen pitoisuus reaktioseoksessa lisää virheiden todennäköisyyttä komplementaarisen DNA-juosteen rakentamisessa.

· Pohjusteet - Optimaalisin on käyttää alukkeita, joiden sulamispisteero on enintään 2 - 4 o C. Joskus pitkäaikaisen varastoinnin aikana 4 °C:n lämpötilassa o Suuren jäädyttämisen - sulatuksen yhteydessä tai sen jälkeen alukkeet muodostavat sekundaarisia rakenteita - dimeerejä, mikä vähentää PCR:n tehokkuutta. Tämän ongelman poistaminen pelkistyy inkubaatioon vesihauteessa (T = 95 o C) 3 minuuttia ja sen jälkeen terävä jäähdytys 0°:een KANSSA.

· DNA-valmisteet - DNA-valmisteen (matriisin) määrä ja laatu vaikuttavat suoraan polymeraasiketjureaktion kulkuun ja parametreihin. Ylimääräinen DNA-näyte estää polymeraasiketjureaktion (PCR). DNA-valmisteen erilaisten aineiden epäpuhtaudet voivat myös heikentää polymeraasiketjureaktion (PCR) tehokkuutta: natriumasetaatti, natriumkloridi, isopropanoli, etanoli, hepariini, fenoli, urea, hemoglobiini jne.

· DNA-polymeraasi - kun käytetään pientä määrää DNA-polymeraasia, havaitaan lopputuotteen synteesin väheneminen suoraan suhteessa fragmenttien kokoon. Polymeraasin kertoimella 2 - 4 ylimäärä johtaa diffuusien spektrien ilmaantumiseen ja kertoimella 4 - 16 - matalan molekyylipainon epäspesifisten spektrien ilmaantumiseen. Käytetty konsentraatioalue on 0,5 - 1,5 aktiivisuusyksikköä 25 µl PCR-seosta kohti.

PCR-seoksen pääkomponenttien lisäksi käytetään useita muita aineita, jotka parantavat PCR:n laadullisia ja kvantitatiivisia parametreja: asetamidi (5%) - pääkomponenttien liukoisuuden lisääntyminen; betaiini (natriumsuola) - DNA-polymeraasin stabilointi, DNA:n sulamispisteen alentaminen, sulamispisteen tasoitus; naudan albumiini (10-100 μg / ml) - DNA-polymeraasin stabilointi; dimetyylisulfoksidi (1-10 %) - lisää pääkomponenttien liukoisuutta; formamidi (2-10 %) - hehkutuksen spesifisyyden kasvu; glyseroli (15-20%) - entsyymin lämpöstabiilisuuden kasvu, DNA-näytteen denaturaatiolämpötilan lasku; ammoniumsulfaatti - alentaa denaturaatio- ja hehkutuslämpötilaa.

1.5.2 Sykli- ja lämpötilaolosuhteet

Yleinen näkemys polymeraasiketjureaktio (PCR) -ohjelmasta on seuraava:

vaiheessa. DNA-valmisteen pitkäaikainen primaarinen denaturaatio 1 sykli

vaiheessa. DNA-valmisteen nopea denaturaatio. Pohjusteiden hehkutus. Pidentymä 30 - 45 sykliä.

vaiheessa. Pitkäaikainen venymä. Reaktioseoksen jäähdyttäminen 1 sykli.

Jokaisella vaiheen elementillä - denaturaatio, hehkutus, venyminen - on yksilölliset lämpötila- ja aikaominaisuudet. Jokaisen elementin lämpötilan ja virtausajan parametrit valitaan empiirisesti vahvistustuotteiden kvalitatiivisten ja kvantitatiivisten indikaattoreiden mukaisesti.

Denaturaatio. Tämän polymeraasiketjureaktion elementin aikana kaksijuosteinen DNA-molekyyli jaetaan kahdeksi yksijuosteiseksi. Denaturoinnin lämpötilaparametrit ovat välillä 90 - 95 o C, mutta jos DNA-näyte sisältää runsaasti guaniinia ja sytosiinia, lämpötila tulee nostaa 98 asteeseen. o C. Denaturaatiolämpötilan on oltava riittävä täydelliseen denaturaatioon - DNA-säikeiden katkaisemiseen ja "äkillisen jäähtymisen" tai nopean pariutumisen välttämiseen, mutta lämpöstabiili DNA-polymeraasi on kuitenkin vähemmän stabiili korkeissa lämpötiloissa. Siten optimaalisten denaturaation lämpötilaparametrien valinta aluke/näyte-suhteelle (DNA-valmistelu) on tärkeä ehto monistuksen suorittamiselle. Jos denaturaatiolämpötila ensimmäisessä vaiheessa on yli 95 o C, suositellaan DNA-polymeraasin lisäämistä reaktioseokseen primaarisen denaturoinnin jälkeen. Tämän vaiheen elementin keston polymeraasiketjureaktion (PCR) aikana tulisi olla riittävä DNA:n täydelliseen denaturoitumiseen, mutta samalla sillä ei ole merkittävää vaikutusta DNA-polymeraasin aktiivisuuteen tietyssä lämpötilassa.

Hehkutus. Hehkutuslämpötila (T a ) on yksi polymeraasiketjureaktion tärkeimmistä parametreista. Hehkutuslämpötila kullekin tietylle pohjamaalille valitaan erikseen. Se riippuu alukkeen pituudesta ja nukleotidikoostumuksesta. Yleensä se on pienempi 2-4 o Sulamispistearvo (T m ) pohjamaali. Jos järjestelmän pariutumislämpötila on alhaisempi kuin optimaalinen, epäspesifisten monistettujen fragmenttien määrä kasvaa ja päinvastoin korkeampi lämpötila vähentää monistuneiden tuotteiden määrää. Tässä tapauksessa spesifisten amplikonien pitoisuus voi laskea jyrkästi polymeraasiketjureaktion (PCR) estämiseen asti. Pariutumisajan pidentyminen johtaa myös epäspesifisten amplikonien lukumäärän kasvuun.

Pidentymä. Yleensä jokaisella lämpöstabiililla DNA-polymeraasityypillä on yksilöllinen aktiivisuuden lämpötilaoptimi. Entsyymin suorittaman komplementaarisen DNA-juosteen synteesinopeus on myös kullekin polymeraasille spesifinen arvo (keskimäärin 30-60 nukleotidia sekunnissa tai 1-2 tuhatta emästä minuutissa), joten venymisaika valitaan riippuen. DNA-polymeraasin tyypistä ja monistetun alueen pituudesta.

1.5.3 Pohjusteen valinnan perusperiaatteet

PCR-testijärjestelmää luotaessa yksi tärkeimmistä tehtävistä on alukkeiden oikea valinta, jonka on täytettävä useita kriteerejä:

Pohjamaalien on oltava erityisiä. Kiinnitä erityistä huomiota 3 - alukkeiden päät, koska juuri niistä Taq-polymeraasi alkaa rakentaa komplementaarista DNA-juostetta. Jos niiden spesifisyys on riittämätön, on todennäköistä, että koeputkessa tapahtuu ei-toivottuja prosesseja reaktioseoksen kanssa, nimittäin epäspesifisen DNA:n (lyhyiden tai pitkien fragmenttien) synteesi. Se näkyy elektroforeesissa raskaiden tai kevyiden lisänauhojen muodossa. Tämä häiritsee reaktiotulosten arviointia, koska spesifinen monistustuote on helppo sekoittaa syntetisoituun vieraan DNA:han. Joitakin alukkeita ja dNTP:itä kulutetaan epäspesifisen DNA:n synteesiin, mikä johtaa merkittävään herkkyyden menetykseen.

Pohjusteet eivät saa muodostaa dimeerejä ja silmukoita, ts. stabiileja kaksoisketjuja ei pitäisi muodostaa alukkeiden yhteen tai toisiinsa kiinnittymisen seurauksena.

1.5.4 "Plateau"-efekti

On huomattava, että spesifisten vahvistustuotteiden kertymisprosessi geometrisessa progressiossa kestää vain rajoitetun ajan, minkä jälkeen sen tehokkuus laskee kriittisesti. Tämä johtuu niin kutsutusta "tasangon" vaikutuksesta.

Vaikutusaika tasangolla käytetään kuvaamaan PCR-tuotteiden kertymistä viimeisten monistussyklien aikana.

Riippuen monistusreaktion olosuhteista ja syklien lukumäärästä vaikutuksen saavuttamishetkellä tasangolla Substraattien (dNTP:t ja alukkeet) käyttö, reagoivien aineiden (dNTP:t ja entsyymit) stabiilisuus, inhibiittoreiden määrä, mukaan lukien pyrofosfaatit ja DNA-dupleksit, kilpailu reaktanteista epäspesifisten tuotteiden tai alukedimeerien kanssa, tietyn tuotteen pitoisuus ja epätäydellinen denaturaatio suuressa pitoisuudessa amplifikaatiotuotteet vaikuttavat.

Mitä pienempi kohde-DNA:n alkupitoisuus, sitä suurempi on reaktion riski "Tämä kohta voi tulla ennen kuin tiettyjen vahvistustuotteiden määrä on riittävä analysoitavaksi, ja tämä voidaan välttää vain hyvin optimoiduilla testijärjestelmillä.

1.5.5 Näytteen valmistelu biologisesta materiaalista

DNA:n erottamiseen käytetään erilaisia ​​tekniikoita tehtävistä riippuen. Niiden ydin on DNA:n uuttaminen (uutto) biologisesta tuotteesta ja epäpuhtauksien poistaminen tai neutralointi, jotta saadaan DNA-valmiste, jonka puhtaus on sopiva PCR:lle.

Marmurin kuvaamaa menetelmää puhtaan DNA-valmisteen saamiseksi pidetään standardina ja siitä on jo tullut klassikko. Se sisältää entsymaattisen proteolyysin, jota seuraa proteiinin poisto ja DNA:n uudelleensaostus alkoholilla. Tällä menetelmällä voit saada puhtaan DNA-valmisteen. Se on kuitenkin melko työlästä ja vaatii työskentelyä aggressiivisten ja pistäviä aineita, kuten fenolia ja kloroformia, kanssa.

Yksi tällä hetkellä suosituista menetelmistä on DNA:n erotusmenetelmä, jonka ovat ehdottaneet Boom et ai. Tämä menetelmä perustuu vahvan kaotrooppisen aineen, guanidiinitiosyanaatin (GuSCN) käyttöön solujen hajoamiseen ja sitä seuraavaan DNA:n sorptioon kantajalle (lasihelmet, piimaa, lasi "maito" jne.). Pesun jälkeen DNA jää näytteeseen adsorboituneena kantajalle, josta se voidaan helposti poistaa eluointipuskurilla. Menetelmä on kätevä, teknologinen ja soveltuu näytteen valmistamiseen monistusta varten. DNA-häviöt ovat kuitenkin mahdollisia johtuen peruuttamattomasta sorptiosta kantajalle sekä lukuisten pesujen yhteydessä. Tämä on erityisen tärkeää, kun näytteessä on pieniä määriä DNA:ta. Lisäksi jopa vähäiset määrät GuSCN:ää voivat estää PCR:n. Siksi tätä menetelmää käytettäessä sorbentin oikea valinta ja teknisten vivahteiden huolellinen noudattaminen ovat erittäin tärkeitä.

Toinen ryhmä näytteenvalmistusmenetelmiä perustuu Chilex-tyyppisten ioninvaihtimien käyttöön, jotka, toisin kuin lasi, eivät adsorboi DNA:ta, vaan päinvastoin reaktiota häiritseviä epäpuhtauksia. Tämä tekniikka sisältää yleensä kaksi vaihetta: näytteen keittäminen ja epäpuhtauksien sorptio ioninvaihtimessa. Menetelmä on erittäin houkutteleva sen yksinkertaisuuden vuoksi. Useimmissa tapauksissa se sopii työskentelyyn kliinisen materiaalin kanssa. Valitettavasti joskus näytteissä on sellaisia ​​epäpuhtauksia, joita ei voida poistaa ioninvaihtimilla. Lisäksi joitain mikro-organismeja ei voida tuhota yksinkertaisella keittämällä. Näissä tapauksissa on tarpeen ottaa käyttöön lisävaiheita näytteen käsittelyyn.

Näin ollen näytteen valmistusmenetelmän valintaa tulee harkita suunniteltujen analyysien tavoitteiden ymmärtämisessä.

1.5.6 Vahvistus

Monistusreaktion suorittamiseksi on tarpeen valmistaa reaktioseos ja lisätä siihen analysoitu DNA-näyte. Tässä tapauksessa on tärkeää ottaa huomioon joitakin alukkeen hehkutuksen ominaisuuksia. Tosiasia on, että analysoitu biologinen näyte sisältää pääsääntöisesti erilaisia ​​DNA-molekyylejä, joihin reaktiossa käytetyillä alukkeilla on osittainen ja joissakin tapauksissa merkittävä homologia. Lisäksi alukkeet voivat liittyä toisiinsa muodostaen alukedimeerejä. Molemmat johtavat merkittävään alukkeiden kulutukseen sivutuotteen (epäspesifisten) reaktiotuotteiden synteesiä varten, ja sen seurauksena heikentää merkittävästi järjestelmän herkkyyttä. Tämä tekee reaktion tulosten lukemisen elektroforeesin aikana vaikeaksi tai mahdottomaksi.

1.6 Standardin PCR-reaktioseoksen koostumus

x PCR-puskuri (100 mM Tris-HCl-liuos, pH 9,0, 500 mM KCl-liuos, 25 mM MgCl2-liuos ) …… .2,5 μl

Vesi (MilliQ) ……………………………………………………… .18,8 μl

Nukleotiditrifosfaattien (dNTP) seos

mm liuos jokaisesta …………………………………………. ……… .0,5 μl

Aluke 1 (10 mM liuos) ……………………………………………….… .1 μl

Aluke 2 (10 mM liuos) ……………………………………………….… .1 μl

DNA-polymeraasi (5 yksikköä / μl) ………………………………………… 0,2 μl

DNA-näyte (20 ng / μl) ……………………………………………… ..1 μl

1.7 Reaktiotulosten arviointi

PCR-tulosten oikean arvioinnin kannalta on tärkeää ymmärtää, että tämä menetelmä ei ole kvantitatiivinen. Teoreettisesti yksittäisten kohde-DNA-molekyylien monistumistuotteet voidaan havaita elektroforeesilla 30-35 syklin jälkeen. Käytännössä tämä tehdään kuitenkin vain tapauksissa, joissa reaktio tapahtuu lähellä ihanteellisia olosuhteissa, mitä elämässä ei usein tapahdu. DNA-valmisteen puhtausasteella on erityisen suuri vaikutus monistustehoon, ts. tiettyjen estäjien läsnäolo reaktioseoksessa, joista voi joissain tapauksissa olla erittäin vaikea päästä eroon. Joskus niiden läsnäolon vuoksi ei ole mahdollista monistaa jopa kymmeniä tuhansia kohde-DNA-molekyylejä. Siten ei useinkaan ole suoraa yhteyttä kohde-DNA:n alkuperäisen määrän ja monistustuotteiden lopullisen määrän välillä.

Luku 2: Polymeraasiketjureaktion sovellukset

PCR:ää käytetään monilla aloilla analyyseihin ja tieteellisiin kokeisiin.

Forensics

PCR:ää käytetään niin kutsuttujen "geneettisten sormenjälkien" vertailuun. Rikospaikalta vaaditaan näyte geneettisestä materiaalista - verta, sylkeä, siemennestettä, hiuksia jne. Häntä verrataan epäillyn geneettiseen materiaaliin. Hyvin pieni määrä DNA:ta riittää, teoriassa - yksi kopio. DNA pilkotaan fragmenteiksi ja monistetaan sitten PCR:llä. Fragmentit erotetaan DNA-elektroforeesilla. Syntynyttä kuvaa DNA-juovien sijainnista kutsutaan geneettiseksi sormenjäljeksi.

Isyyden vahvistaminen

PCR:llä monistettujen DNA-fragmenttien elektroforeesin tulokset. Isä. Lapsi. Äiti. Lapsi peri osan molempien vanhempien geneettisen jäljen ominaisuuksista, mikä antoi uuden, ainutlaatuisen jäljen.

Vaikka geneettiset sormenjäljet ​​ovat ainutlaatuisia, perhesiteet voidaan silti muodostaa tekemällä useita tällaisia ​​sormenjälkiä. Samaa menetelmää voidaan soveltaa, hieman muunneltuna, evolutionaarisen sukulaisuuden määrittämiseksi organismien välillä.

Lääketieteellinen diagnostiikka

PCR mahdollistaa perinnöllisten ja virusperäisten sairauksien diagnosoinnin merkittävästi nopeuttamisen ja helpon. Haluttu geeni monistetaan PCR:llä käyttäen sopivia alukkeita ja sekvensoidaan sitten mutaatioiden havaitsemiseksi. Virusinfektiot voidaan havaita heti tartunnan jälkeen, viikkoja tai kuukausia ennen taudin oireiden ilmaantumista.

Henkilökohtainen lääketiede

Joskus lääkkeet ovat myrkyllisiä tai allergiaa aiheuttavia joillekin potilaille. Syynä tähän ovat osittain yksilölliset erot lääkkeiden ja niiden johdannaisten herkkyydessä ja metaboliassa. Nämä erot määräytyvät geneettisellä tasolla. Esimerkiksi yhdellä potilaalla tietty sytokromi voi olla aktiivisempi, toisessa - vähemmän. Sen määrittämiseksi, millaista sytokromia tietyllä potilaalla on, ehdotettiin PCR-analyysin suorittamista ennen lääkkeen käyttöä. Tätä analyysiä kutsutaan esigenotyypitykseksi.

Geenikloonaus

Geenikloonaus on prosessi, jossa geenejä eristetään ja geenitekniikan manipulaatioiden seurauksena saadaan suuri määrä tietyn geenin tuotetta. PCR:llä monistetaan geeni, joka sitten liitetään vektoriin - DNA-palaan, joka siirtää vieraan geenin samaan tai toiseen, kasvatukseen sopivaan organismiin. Vektoreina käytetään esimerkiksi plasmideja tai virus-DNA:ta. Geenien liittämistä vieraaseen organismiin käytetään yleensä tämän geenin tuotteen - RNA:n tai useammin proteiinin - saamiseksi. Siten monia proteiineja saadaan teollisina määrinä käytettäväksi maataloudessa, lääketieteessä jne.

DNA-sekvensointi

Fluoresoivasti leimattuja tai radioaktiivisia isotooppi-dideoksinukleotideja käyttävässä sekvensointimenetelmässä PCR on olennainen osa, koska juuri polymeroinnin aikana DNA-juosteeseen liitetään fluoresoivalla tai radioaktiivisella leimalla leimattuja nukleotidijohdannaisia. Tämä pysäyttää reaktion, jolloin spesifisten nukleotidien sijainti voidaan määrittää syntetisoitujen juosteiden erottamisen jälkeen geelissä.

Mutageneesi

Tällä hetkellä PCR:stä on tullut tärkein menetelmä mutageneesin suorittamiseksi. PCR:n käyttö mahdollisti mutageneesin suorittamismenettelyn yksinkertaistamisen ja nopeuttamisen sekä sen luotettavuuden ja toistettavuuden.

PCR-menetelmä mahdollisti ihmisen papilloomavirussekvenssien läsnäolon analysoinnin ihmisen kohdunkaulan kasvaimien biopsialeikkeissä, jotka oli upotettu parafiiniin 40 vuotta ennen tätä tutkimusta. Lisäksi PCR:n avulla oli mahdollista monistaa ja kloonata mitokondrioiden DNA-fragmentteja 7 tuhatta vuotta vanhoista ihmisaivojen fossiilisista jäännöksistä!

Kyky analysoida samanaikaisesti kahta eri ei-homologisissa kromosomeissa sijaitsevaa lokusta on osoitettu yksittäisten ihmisen siittiöiden lysaateissa. Tämä lähestymistapa tarjoaa ainutlaatuisen mahdollisuuden hienoon geneettiseen analyysiin ja kromosomaalisen rekombinaation, DNA-polymorfismin jne. tutkimukseen. Yksittäisten siittiöiden analyysimenetelmä löysi heti käytännön sovelluksen oikeuslääketieteessä, koska haploidisten solujen HLA-tyypitys mahdollistaa isyyden määrittämisen tai syyllisen tunnistamisen. (HLA-kompleksi on ihmisen pääasiallisen geenit; HLA-kompleksin lokukset ovat polymorfisimpia kaikista korkeammissa selkärankaisissa tunnetuista: lajin sisällä kussakin lokuksessa on epätavallisen suuri määrä erilaisia ​​alleeleja - vaihtoehtoisia sama geeni).

PCR:n avulla on mahdollista paljastaa vieraiden geneettisten rakenteiden integroinnin oikeellisuus tutkittavien solujen genomin ennalta määrätylle alueelle. Solun kokonais-DNA yhdistetään kahdella oligonukleotidialukkeella, joista toinen on komplementaarinen isäntä-DNA-alueelle lähellä insertiokohtaa ja toinen antiparalleelisessa DNA-juosteessa olevan integroidun fragmentin sekvenssin kanssa. Jos kromosomin DNA:n rakenne on muuttumaton ehdotetussa insertiokohdassa, polymeraasiketjureaktio johtaa määrittelemättömän kokoisten yksijuosteisten DNA-fragmenttien muodostumiseen, ja suunnitellussa insertiossa kaksijuosteisten DNA-fragmenttien muodostumiseen. tunnettu koko, joka määräytyy kahden alukkeen pariutumiskohtien välisen etäisyyden perusteella. Lisäksi genomin analysoidun alueen monistumisaste on ensimmäisessä tapauksessa lineaarisesti riippuvainen syklien lukumäärästä ja toisessa - eksponentiaalisesti. Aiemmin tunnetun kokoisen monistetun fragmentin eksponentiaalinen kerääntyminen PCR:n aikana mahdollistaa sen visuaalisen havainnoinnin DNA-valmisteen elektroforeettisen fraktioinnin jälkeen ja tekee yksiselitteisen johtopäätöksen vieraan sekvenssin liittämisestä tietylle kromosomaalisen DNA:n alueelle.

Johtopäätös

Yleisin PCR-menetelmä on tällä hetkellä vastaanotettu menetelmänä erilaisten tartuntatautien diagnosointiin. PCR:n avulla voit tunnistaa infektion etiologian, vaikka analysoitavaksi otettu näyte sisältäisi vain muutaman taudinaiheuttajan DNA-molekyylin. PCR:ää käytetään laajalti HIV-infektioiden, virushepatiitin jne. varhaisessa diagnosoinnissa. Nykyään ei ole läheskään yhtään tartunnanaiheuttajaa, jota ei voitaisi havaita PCR:llä.

Luettelo käytetystä kirjallisuudesta

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Molekyyligeneettiset analyysimenetelmät. - Minsk: Unipol, 2007 .-- 176 s.

2.PCR "reaaliajassa" / Rebrikov DV, Samatov GA, Trofimov D.Yu. jne.; toim. d. b. n. D.V. Rebrikov; esipuhe LA. Osterman ja Acad. RAS ja RAAS E.D. Sverdlov; 2. painos, Rev. ja lisää. - M .: BINOM. Knowledge Laboratory, 2009 .-- 223 s.

.Patrushev L.I. Keinotekoiset geneettiset järjestelmät. - M .: Nauka, 2005. - 2 nidettä

.B. Glick, J. Pasternak Molecular Biotechnology. Periaatteet ja soveltaminen 589 s., 2002

5.Shchelkunov S.N. Geenitekniikka. - Novosibirsk: Sib. univ. kustantamo, 2004. - 496 s.

Toimittanut A.A. Vorbieva "Polymeraasiketjureaktio ja sen sovellus dermatovenerologian diagnostiikkaan"; Lääketieteellinen uutistoimisto - 72 s.

Http: // ru. wikipedia.org

Http: // tutkija. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http:// prizvanie. su / - lääketieteellinen päiväkirja

Tutorointi

Tarvitsetko apua aiheen tutkimiseen?

Asiantuntijamme neuvovat tai tarjoavat tutorointipalveluita sinua kiinnostavista aiheista.
Lähetä pyyntö aiheen merkinnällä juuri nyt saadaksesi selville mahdollisuudesta saada konsultaatio.

GOU VPO "Krasnojarskin valtion lääketieteellinen akatemia

nimetty Yasenetskyn liittovaltion terveydenhuollon ja sosiaalisen kehityksen viraston mukaan "

Lääketieteellisen genetiikan ja kliinisen neurofysiologian laitos IPO

MENETELMÄN PERUSPERIAATTEET

POLYMERAASI KETJUREAKTIO

Metodologinen opas 3-4-vuotiaille opiskelijoille

yleislääketieteen erikoisaloilla (060101) ja

Krasnojarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Polymeraasiketjureaktiomenetelmän perusperiaatteet. Menetelmäkäsikirja yleislääketieteen (060101) ja pediatrian (060103) erikoisalojen 3-4-vuotiaiden opiskelijoiden opetuksen ulkopuoliseen työhön. - Krasnojarsk: Kustantaja GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42 s.

Metodologinen käsikirja täyttää täysin valtion standardin (2000) vaatimukset ja heijastaa nykyaikaisen perinnöllisten ihmisten sairauksien diagnosointimenetelmän päänäkökohtia - polymeraasiketjureaktiomenetelmää, opetusmateriaali on mukautettu koulutustekniikoihin ottaen huomioon erityispiirteet. koulutusta 3-4 lääketieteellisen ja lastenlääketieteellisen tiedekunnan kurssilla.

Arvostelijat: Lääketieteellisen genetiikan osaston johtaja, GOU VPO

Liittovaltion terveydenhuollon ja sosiaalisen kehityksen viraston Novosibirskin osavaltion lääketieteellinen yliopisto, lääketieteen tohtori, professori;

DNA kopiointi

Tämän menetelmän tutkimuskohteena on deoksiribonukleiinihappo (DNA). DNA on yleinen geneettisen tiedon kantaja kaikille maan päällä oleville organismeille (lukuun ottamatta RNA:ta sisältäviä mikro-organismeja). DNA on kaksoisjuoste, joka on kiertynyt kierteeksi. Jokainen juoste koostuu sarjaan kytketyistä nukleotideista. DNA-säikeillä on päinvastainen suunta: yhden juosteen 5 "pää vastaa toisen juosteen 3" päätä. DNA:n ainutlaatuinen ominaisuus on sen kyky monistua. Tätä prosessia kutsutaan replikointi... DNA-molekyylin replikaatio tapahtuu interfaasin synteettisen jakson aikana. Kumpikin "emo"-molekyylin kahdesta ketjusta toimii matriisina "tyttärelle". Replikaation jälkeen äskettäin syntetisoitu DNA-molekyyli sisältää yhden "äiti"-ketjun ja toisen "tytär", vasta syntetisoidun (puolikonservatiivinen menetelmä). Uuden DNA-molekyylin matriisisynteesiä varten on välttämätöntä, että vanha molekyyli poistetaan spiraalista ja venytetään. Replikaatio alkaa useista kohdista DNA-molekyylissä. DNA-molekyylin osaa yhden replikaation aloituspisteestä toisen alkupisteeseen kutsutaan replikoni.

Replikoinnin aloitus on aktivoitu alukkeet(siemenet), jotka koostuvat 100-200 emäsparista. DNA-helikaasientsyymi purkaa ja jakaa äidin DNA-heliksin kahdeksi juosteeksi, joihin komplementaarisuuden periaatteen mukaisesti DNA-polymeraasientsyymin osallistuessa kootaan "tytär"-DNA-säikeitä. Jotta entsyymi voisi aloittaa toimintansa, tarvitaan aloituslohko - pieni alkuperäinen kaksijuosteinen fragmentti. Aloituslohko muodostuu, kun aluke on vuorovaikutuksessa alkuperäisen DNA:n vastaavan juosteen komplementaarisen alueen kanssa. Jokaisessa replikonissa DNA-polymeraasi voi liikkua "emäjuostetta" pitkin vain yhteen suuntaan (5` => 3`).

Johtavassa säikeessä replikonin purkautuessa "tytär"-ketju rakentuu vähitellen jatkuvasti. Jäljellä olevalla langalla tytärketju syntetisoi myös suunnassa (5` => 3`), mutta erillisinä fragmentteina replikonin käämittyessä.

Siten "tytär"-säikeiden komplementaaristen nukleotidien lisäys tapahtuu vastakkaisiin suuntiin (antirinnakkais). Replikaatio kaikissa replikoneissa tapahtuu samanaikaisesti. "Tytär"-lankojen fragmentit ja osat, jotka on syntetisoitu eri replikoneina, ompelevat yhdeksi langaksi entsyymiligaasi. Replikaatiolle on ominaista puolikonservatiivisuus, anti-rinnakkaisisuus ja epäjatkuvuus. Solun koko genomi replikoituu kerran yhtä mitoottista sykliä vastaavan ajanjakson aikana. Replikaatioprosessin tuloksena yhdestä DNA-molekyylistä muodostuu kaksi DNA-molekyyliä, joista toinen juoste on peräisin emo-DNA-molekyylistä ja toinen, tytär, syntetisoituu vasta (kuvio 1).

Riisi. 1. DNA-molekyylin replikaatiokaavio.

Siten DNA-replikaatiosykli sisältää kolme päävaihetta:

1. DNA-kierteen irtoaminen ja juosteen erottaminen (denaturaatio);

2. pohjamaalien kiinnitys;

3. lapsilangan ketjun loppuun saattaminen.

PCR-menetelmän periaate

DNA:n replikaatio muodosti PCR:n perustan. PCR:ssä yllä mainitut prosessit suoritetaan koeputkessa syklisessä tilassa. Siirtyminen reaktiovaiheesta toiseen saavutetaan muuttamalla inkubointiseoksen lämpötilaa. Kun liuos kuumennetaan 93-95 °C:seen, DNA denaturoituu. Seuraavaan vaiheeseen siirtymiseksi - alukkeiden kiinnittämiseen tai "hehkutukseen" - inkubointiseos jäähdytetään 50-65 ° C:seen. Sitten seos kuumennetaan 70-72 °C:seen - taq-DNA-polymeraasin optimaalinen työ - tässä vaiheessa uusi DNA-juoste valmistuu. Sitten sykli toistetaan uudelleen. Toisin sanoen PCR-menetelmä on moninkertainen kopiomäärän lisääminen (vahvistusta) DNA-polymeraasientsyymin katalysoima DNA:n tietty alue.

Tytär-DNA-säikeiden pidentymisen tulee tapahtua samanaikaisesti molemmissa äidin DNA:n juosteissa, joten toisen juosteen replikaatioon tarvitaan myös aluke. Siten reaktioseokseen lisätään kaksi aluketta: yksi "+" -ketjua varten, toinen "-" -ketjua varten. Kiinnittyään DNA-molekyylin vastakkaisiin juosteisiin alukkeet rajoittavat sen osan, joka myöhemmin monistuu tai monistuu monta kertaa. Tällaisen fragmentin, jota kutsutaan amplikoniksi, pituus on yleensä useita satoja nukleotideja.

PCR-vaiheet

Jokainen vahvistussykli sisältää 3 vaihetta, jotka tapahtuvat eri lämpötilaolosuhteissa (kuvio 2).

· Vaihe 1: DNA:n denaturaatio . Se toimii 93-95 °:ssa 30-40 sekuntia.

· Vaihe 2: hehkutuspohjamaalit . Alukkeiden kiinnittäminen on komplementaarista vastaaville sekvensseille vastakkaisissa DNA-juosteissa tietyn kohdan rajoilla. Jokaisella pohjamaaliparilla on oma hehkutuslämpötilansa, jonka arvot ovat välillä 50-65 °C. Hehkutusaika 20-60 sek.

· Vaihe 3: DNA-juosteen pidennys Komplementaarinen DNA-juosteen pidennys tapahtuu ketjun 5 "päästä 3" päähän vastakkaisiin suuntiin, alkaen alukkeen kiinnityskohdista. Liuokseen lisätyt toimivat materiaalina uusien DNA-säikeiden synteesiin. Synteesiprosessia katalysoi taq-polymeraasientsyymi ja se tapahtuu 70-72 °C:n lämpötilassa. Synteesin kesto on 20-40 sekuntia.

Ensimmäisessä monistussyklissä muodostuneet uudet DNA-juosteet toimivat templaatteina toiselle monistussyklille, jossa muodostuu spesifinen DNA-amplikonin fragmentti (kuvio 3). Seuraavilla monistuskierroksilla amplikonit toimivat mallina uusien juosteiden synteesille.

Siten liuoksessa on amplikonien kertymistä kaavan 2" mukaisesti, jossa n on monistussyklien lukumäärä. Näin ollen, vaikka alkuperäisessä liuoksessa oli alun perin vain yksi kaksijuosteinen DNA-molekyyli, noin 108 amplikonimolekyyliä kertyy liuokseen 30-40 syklin aikana, määrä on riittävä tämän fragmentin luotettavaan visuaaliseen havaitsemiseen agaroosigeelielektroforeesilla.

Vahvistusprosessi suoritetaan erityisessä ohjelmoitavassa termostaatissa ( vahvistin), joka tietyn ohjelman mukaan muuttaa automaattisesti lämpötiloja vahvistusjaksojen lukumäärän mukaan.

Vahvistuksen suorittamiseen tarvitaan seuraavat komponentit:

· DNA-matriisi(DNA tai sen osa, joka sisältää halutun spesifisen fragmentin);

· Pohjusteet(synteettiset oligonukleotidit (20-30 nukleotidiparia), jotka ovat komplementaarisia DNA-sekvensseille määritetyn spesifisen fragmentin rajoilla). Spesifisen fragmentin valinnalla ja alukkeiden valinnalla on tärkeä rooli monistuksen spesifisyydessä, mikä vaikuttaa määrityksen laatuun.

· Deoksinukleotiditrifosfaatti (dNTP) seos(seos neljästä dNTP:stä, jotka ovat materiaalia uusien komplementaaristen DNA-säikeiden synteesiin vastaavina pitoisuuksina 200-500 μm)

· EntsyymiTaq-polymeraasi(lämpöstabiili DNA-polymeraasi, katalysoi alukeketjujen pidentymistä kiinnittämällä nukleotidiemäksiä peräkkäin syntetisoidun DNA:n kasvavaan ketjuun, 2-3 mM).

· Puskuriliuos(reaktioväliaine, joka sisältää Mg2+-ioneja, jotka ovat välttämättömiä entsyymin aktiivisuuden ylläpitämiseksi, PH 6,8-7,8).

RNA:ta sisältävien virusten genomin spesifisten alueiden määrittämiseksi RNA-templaatista saadaan ensin DNA-kopio käyttämällä käänteiskopioijaentsyymin (käänteistranskriptaasi) katalysoimaa käänteiskopioijareaktiota (RT).

Riisi. 2. Vahvistus (1. sykli).

Riisi. 3. Vahvistus (2. sykli).

PCR:n tärkeimmät käyttöalueet

Kliininen lääke:

o infektioiden diagnoosi,

o mutaatioiden havaitseminen, mukaan lukien perinnöllisten sairauksien diagnostiikka,

o genotyypitys, mukaan lukien HLA-genotyypitys,

o soluteknologiat

Ekologia (tapana seurata ympäristön esineiden ja elintarvikkeiden tilaa ja laatua)

Siirtogeenisten organismien (GMO) määritys

Henkilöllisyystodistus, isyys, oikeuslääketiede

Yleinen ja yksityinen biologia,

Perusperiaatteet

diagnostisten laboratorioiden järjestäminen

Työ PCR-laboratoriossa suoritetaan "Laitteen sääntöjen, turvatoimien, teollisuuden sanitaatiota, epidemiantorjuntajärjestelmää ja henkilökohtaista hygieniaa koskevien sääntöjen mukaisesti työskennellessään terveydenhuoltojärjestelmän terveys- ja epidemiologisten laitosten laboratorioissa (osastot, osastot) ."

DNA-näytteiden kontaminaatio

PCR-diagnostiikan suorittamiseen liittyy ongelma, joka johtuu menetelmän korkeasta herkkyydestä - mahdollisuudesta saastuminen. Pienten määrien positiivista DNA:ta (DNA-monistuksen spesifiset tuotteet - amplikonit; positiivisena kontrollina käytetty DNA-standardi; kliinisen näytteen positiivinen DNA) nieleminen reaktioputkeen johtaa tietyn DNA-fragmentin monistumiseen PCR:n aikana ja mm. seurauksena vääriin positiivisiin tuloksiin.

Työprosessissa saattaa olla kahdenlaisia ​​saasteita:

1. ristiin saastuminen näytteestä näytteeseen (kliinisten näytteiden käsittelyn aikana tai reaktioseosta annosteltaessa), mikä johtaa satunnaisten väärien positiivisten tulosten ilmaantumiseen;

2. amplifikaatiotuotteiden saastuminen(amplikonit), mikä on tärkeintä, koska amplikoneja kertyy valtavia määriä PCR-prosessin aikana ja ne ovat ihanteellisia tuotteita uudelleenamplifikaatioon.

Lasivälineiden, automaattisten pipettien ja laboratoriolaitteiden, laboratoriopöytien pinnan tai jopa laboratoriohenkilöstön ihon pinnan jälkikontaminaatio johtaa systemaattisiin vääriin positiivisiin tuloksiin. Saastumislähteen määrittäminen voi olla erittäin vaikeaa, aikaa vievää ja kallista. Tähän mennessä saatu kokemus diagnostiikassa PCR-menetelmää käyttävien laboratorioiden työskentelystä mahdollistaa perusvaatimusten muotoilun tällaisten laboratorioiden organisaatiolle ja itse analyysien suorittamiselle. Näiden vaatimusten noudattaminen eliminoi saastumisen ja väärien positiivisten tulosten mahdollisuuden.

PCR-analyysin vaiheet

Ne on jaettu alueellisesti sijoittamalla ne erillisiin huoneisiin (kuva 4.5):

· PCR-huone, jossa suoritetaan kliinisten näytteiden käsittely, DNA-uutto, reaktioseoksen valmistelu PCR:ää varten ja PCR-asetus (jos olosuhteet ovat olemassa, myös kaksi viimeistä vaihetta suositellaan suoritettavaksi erillisessä lisähuoneessa). Näissä tiloissa on kiellettyä tehdä kaikenlaisia ​​muita töitä tutkittavilla aineilla, joiden PCR-diagnostiikka suoritetaan tässä laboratoriossa.

· Post-PCR-huone, jossa amplifikaatiotuotteiden havaitseminen suoritetaan. Tässä huoneessa voidaan käyttää muita tunnistusmenetelmiä. On suositeltavaa sijoittaa tila amplifikaatiotuotteiden havaitsemista varten mahdollisimman kauas PCR-a edeltäneistä huoneista.

Työhuoneet on varustettu ultraviolettilampuilla, joiden maksimisäteily on 260 nm alueella (tyyppi DB-60) nopeudella 2,5 W per 1 m3. Valaisimet on sijoitettu siten, että työpöytien pinnat, laitteet ja materiaalit, joihin käyttäjä joutuu kosketuksiin PCR-analyysin aikana, altistuvat suoralle säteilylle. Säteilytys suoritetaan tunnin sisällä ennen työn aloittamista ja tunnin sisällä työn päättymisestä.

Lääkärit-laboratorioavustajat työskentelevät erityisissä laboratoriovaatteissa, jotka vaihdetaan siirryttäessä huoneesta toiseen, ja kertakäyttökäsineissä. Eri tilojen vaatteet käsitellään erikseen. Eri työntekijät työskentelevät PCR-analyysin eri vaiheissa.

Käytä työhön erillisiä annostelijasarjoja, muovi- ja lasiesineitä, laboratoriolaitteita, kylpytakeita ja käsineitä, jotka on suunniteltu eri analyysivaiheisiin ja joita ei siirretä huoneesta toiseen. Jokaisen huoneen varusteet, materiaalit ja inventaario on merkitty vastaavasti.

Kaikki työvaiheet suoritetaan vain käyttämällä kertakäyttöisiä tarvikkeita: automaattipipettien kärjet, koeputket, käsineet jne. Muista vaihtaa kärjet siirtyessäsi näytteestä näytteeseen. Käytä aerosolisulkusuodattimella varustettuja kärkiä estääksesi liuoksen mikropisaroiden pääsyn pipettiin. Käytetyt putket ja kärjet hävitetään erityisiin tai desinfiointiliuosta sisältäviin astioihin. Säilytä kliiniset näytteet erillään reagensseista.

Työpaikan käsittelyä ja siivoamista varten jokaisessa huoneessa on vanupuupuikkoja (lautasliina), pinsettejä, desinfiointi- ja inaktivointiliuoksia.

PCR-diagnostiikkalaboratoriossa ei saa tehdä töitä, jotka liittyvät tässä laboratoriossa diagnosoitujen patogeenien DNA-sekvenssejä tai geenifragmentteja sisältävien rekombinanttiplasmidien tuotantoon (kloonaukseen) ja eristämiseen.

Kliinisen materiaalin kokoelma

PCR:n testimateriaalina voidaan käyttää raaputettuja epiteelisoluja, verta, plasmaa, seerumia, keuhkopussin ja selkäydinnestettä, virtsaa, ysköstä, limaa ja muita biologisia eritteitä, biopsioita.

Materiaali otetaan vastaavan profiilin hoitohuoneessa. Keräyksen jälkeen näytteet tulee toimittaa PCR-diagnostiikkalaboratorioon mahdollisimman pian.

Näytteet tulee ottaa steriileillä, mieluiten kertakäyttöisillä instrumenteilla vain kertakäyttöisiin steriileihin muovisiin koeputkiin tai lasisiin koeputkiin, jotka on esikäsitelty tunnin ajan kromiseoksella, pestään perusteellisesti tislatulla vedellä ja kalsinoidaan uunissa 150 °C:ssa 1 tunnin ajan.

Havaintoalue (toinen kerros tai toinen rakennus).

Riisi. 4. PCR-laboratoriolaite elektroforeesitunnistuksella.

Havaintoalue (toinen kerros tai toinen rakennus)

Riisi. 5. PCR-laboratoriolaite fluoresenssitunnistimella (kvantitatiivinen analyysi).

Riisi. 6. DNA:n erotushuone. Kuvassa on pöytälaatikko, jossa on bakteereita tappava lamppu.

Riisi. 7. Vahvistushuone.

Riisi. kahdeksan. Havaintohuone.

Riisi. yhdeksän. Verinäytteet perinnöllisten sairauksien DNA-diagnostiikkaan.

Näytteiden varastointi ja kuljetus

Perinnöllisten sairauksien diagnosoimiseksi verinäytteitä säilytetään erikoispaperilomakkeilla tai muoviputkissa pitkään jäädytettynä (kuva 9).

Tartuntatautien diagnosointia varten näytteitä pidetään huoneenlämmössä enintään 2 tuntia. Jos tarvitaan pidempää säilytystä, näytteet voidaan laittaa jääkaappiin, jonka lämpötila on 2-8 ° C, enintään vuorokauden ajaksi. Pidempi varastointi (enintään 2 viikkoa) on sallittu jäädytettynä pakastimessa miinus 20 °C:n lämpötilassa. Näytteiden toistuva jäädyttäminen ja sulattaminen ei ole sallittua.

Jos PCR-diagnostiikkalaboratorio ja näytteenottotila on maantieteellisesti erotettu toisistaan, näytteiden kuljetus on suoritettava termosissa tai lämpösäiliöissä näytteiden säilytyssääntöjä ja tartuntamateriaalien kuljetussääntöjä noudattaen.

DNA:n eristäminen näytteistä

Kiinteän faasin sorptiomenetelmä on yleistynyt, joka koostuu guanidiiniliuosta sisältävän hajottavan aineen lisäämisestä, DNA:n sorptiosta sorbentille sekä DNA:n toistuvasta pesusta ja resorptiosta puskuriliuoksella. Seerumin, plasman tai kokoveren tapauksessa käytetään yleensä fenoliuuttomenetelmää. Menetelmä sisältää proteiininpoiston fenolilla/kloroformilla ja sen jälkeen DNA:n (tai RNA:n) saostuksen etanolilla tai isopropanolilla. Käsittely suoritetaan 1,5 ml:n Eppendor P -mikrosentrifugiputkissa. Käsittelyaika on 1,5-2 tuntia (kuva 10).

Riisi. kymmenen. DNA:n eristäminen.

PCR:n suorittaminen

Tietty määrä näytettä käsitellystä kliinisestä näytteestä siirretään erityiseen Eppendorf-tyyppiseen mikrosentrifugiputkeen, jonka tilavuus on 0,2 tai 0,5 ml. Lisätään amplifikaatioseos, joka koostuu vedestä, PCR-puskurista, dNTP-liuoksesta, alukeliuoksesta ja liuoksesta. samaan putkeen Taq-polymeraasi (lisätään seokseen viimeisenä) Tyypillisesti reaktioseoksen tilavuus on 25 µl. Sitten jokaiseen putkeen lisätään yksi tippa mineraaliöljyä estämään reaktioseoksen haihtuminen monistuksen aikana. Putket siirretään ohjelmoitavaan termostaattiin (vahvistimeen), jossa vahvistus suoritetaan automaattisessa tilassa tietyn ohjelman mukaan (kuva 11).

Riisi. yksitoista. vahvistin" Lämpöpyöräilijä ».

Reaktioaika on valitusta ohjelmasta riippuen 2-3 tuntia. Rinnakkain koenäytteiden kanssa asetetaan kontrollinäytteitä: positiivinen kontrolli sisältää kaikki reaktion komponentit, mutta kliinisen näytteen materiaalin sijaan otetaan käyttöön tutkittavan geenin kontrolli-DNA-valmiste. Negatiivinen kontrolli sisältää kaikki reaktion komponentit, mutta kliinisen materiaalin tai DNA-valmisteen sijaan lisätään sopiva määrä deionisoitua vettä tai uutetta, joka ei sisällä tutkittavaa DNA:ta. Negatiivinen kontrolli on tarpeen reaktion komponenttien tarkistamiseksi, ettei niissä ole DNA:ta kontaminaatiosta johtuen, ja väärien positiivisten tulosten kirjaamisen poissulkemiseksi.

Tulosten rekisteröinti

Monistettu spesifinen DNA-fragmentti havaitaan agaroosigeelielektroforeesilla etidiumbromidin läsnä ollessa. Etidiumbromidi muodostaa DNA-fragmenttien kanssa stabiilin implantaatioyhdisteen, joka näkyy valonauhoina, kun geeliä säteilytetään UV-säteilyllä, jonka aallonpituus on 290-330 nm. Saatujen PCR-amplikonien koosta riippuen käytetään geeliä, jonka agaroosipitoisuus on 1,5 % - 2,5 %. Agaroosigeelin valmistamiseksi agaroosin, puskurin ja veden seos sulatetaan mikroaaltouunissa tai vesihauteessa ja lisätään etidiumbromidiliuos. 50-60 °C:seen jäähdytetty seos kaadetaan muottiin 4-6 mm paksuisella kerroksella ja geeliin tehdään erityisillä kammoilla taskuja näytteen levittämistä varten. Kammat asetetaan niin, että kuoppien pohjan ja geelin pohjan väliin jää 0,5-1 mm agaroosikerros. Geelin jähmettymisen jälkeen taskuihin laitetaan amplifikaattia 5-15 μl. On suositeltavaa suorittaa elektroforeesi DNA-fragmentin pituusmarkkerien seoksesta rinnakkain kontrolli- ja koenäytteiden kanssa. Tyypillisesti tällainen seos sisältää kymmenen DNA-fragmenttia, joissa on 100, 200, 300 jne. emäsparia.

Asettamalla tällaisen näytteen voit tarkistaa amplikonien pituuden kontrolli- ja koenäytteissä. Geeli levitetyn näytteen kanssa siirretään puskurilla täytettyyn elektroforeesikammioon, kammio liitetään virtalähteeseen ja vahvistustuotteiden elektroforeettinen erotus suoritetaan 30-45 minuutin ajan sähkökentän voimakkuudella 10-15 V / cm. Tässä tapauksessa reaktioseokseen sisältyvän väriaineen etuosan tulee kulkea vähintään 3 cm.

Elektroforeesin päätyttyä geeli siirretään transilluminaattorin lasille ja sitä tarkastellaan ultraviolettivalossa. Dokumentaatiota varten geeli valokuvataan Micrat 300 -filmille tai tallennetaan tietokoneeseen liitetyn videojärjestelmän avulla.

Kontrollinäytteet arvioidaan ensin. Positiivisen kontrollin elektroforeettisen kaistan tulee olla oranssi valonauha. Sen elektroforeettisen liikkuvuuden tulee vastata ohjeissa määriteltyä amplikonin pituutta.

Negatiivista kontrollia vastaavassa elektroforeettisessa kaistassa tällaisen vyöhykkeen tulisi puuttua. Tällaisen juovan läsnäolo negatiivisessa kontrollissa osoittaa kontaminaatiota - käytettyjen reagenssien kontaminaatiota analysoidulla DNA:lla tai amplikonilla. Testinäytteistä arvioidaan nauhan läsnäolo vastaavalla kaistalla, joka sijaitsee samalla tasolla kuin positiivisen kontrollinäytteen liuska. Vyöhykkeen luminesenssin intensiteetti vastaa näytteessä olevan analysoidun DNA:n määrää, mikä mahdollistaa PCR:n semikvantitatiivisen arvioinnin. Yleensä positiivisia tuloksia arvioidaan nelipisteasteikolla. Jos koenäytteen vyöhykkeen luminesenssi on erittäin heikko, tällainen näyte tulee järjestää uudelleen (kuva 12).

Riisi. 12. Agaroosigeelielektroforeesi.

PCR-sovelluksetpistemutaatioiden ja geenipolymorfismien diagnostiikka

Yksi PCR:n johtavista soveltamisalueista käytännön terveydenhuollossa on pistemutaatioiden ja geenipolymorfismien diagnosointi. . DNA-diagnostiikan suorat ja epäsuorat menetelmät erotetaan toisistaan. Tilanteissa, joissa tiedetään geeni, jonka vaurioituminen johtaa perinnöllisen sairauden kehittymiseen, tämä vaurio voidaan havaita molekyyligeneettisillä menetelmillä. Tällaisia ​​menetelmiä kutsutaan suoriksi. Suorien menetelmien avulla havaitaan poikkeamat DNA:n primaarisessa nukleotidisekvenssissä (mutaatiot ja niiden tyypit). Suorille menetelmille on ominaista lähes 100 %:n tarkkuus.

Käytännössä näitä menetelmiä voidaan kuitenkin soveltaa tietyissä olosuhteissa.:

Perinnöllisen sairauden kehittymisestä vastaavan geenin tunnettu sytogeneettinen sijainti;

· Taudin geeni on kloonattava ja sen nukleotidisekvenssi tunnettava.

Suoran DNA-diagnostiikan tarkoituksena on tunnistaa mutanttialleelit.

Siten tilanteissa, joissa tiedetään tarkalleen, mikä DNA-vaurio johtaa perinnölliseen sairauteen, vaurion sisältävä DNA-fragmentti tutkitaan suoraan, eli käytetään suoraa DNA-diagnostiikan menetelmää.

Tähän mennessä monien sairauksien geenejä ei kuitenkaan ole kartoitettu, niiden eksoni-introni-organisaatiota ei tunneta, ja monille perinnöllisille sairauksille on ominaista selvä geneettinen heterogeenisyys, mikä ei salli suorien DNA-diagnostiikan menetelmien täysimääräistä käyttöä. Siksi tapauksissa, joissa vaurion lokalisaatiota ei tiedetä, käytetään erilaista lähestymistapaa, joka liittyy geenisairaudesta vastuussa olevan geenin läheisyyden tutkimukseen yhdistettynä perheanalyysiin, toisin sanoen epäsuoriin molekyyligeneettisen diagnoosin menetelmiin. perinnöllisiä sairauksia käytetään.

Pistemutaatioiden ja pienten deleetioiden havaitsemiseen voidaan käyttää erilaisia ​​menetelmiä, mutta ne kaikki perustuvat PCR-menetelmän käyttöön. Tämän reaktion avulla voit moninkertaistaa DNA-nukleotidisekvenssin monta kertaa ja etsiä sitten mutaatioita. Menetelmät mutaatioita sisältävien DNA-fragmenttien etsimiseksi perustuvat mutanttien ja normaalien DNA-nukleotidisekvenssien vertailevaan analyysiin.

PCR-tuotteiden analyysi

suoran DNA-diagnostiikan prosessissa

Olettaa monistetun geenialueen erityispiirteiden tutkimuksen. Siten trinukleotiditoistojen laajenemisen aiheuttamissa sairauksissa monistustuotteet eroavat pituudeltaan (heijastaen erilaista triplettien määrää tutkittavalla geenialueella) ja sen seurauksena niiden liikkumisnopeudessa geelissä. Tämän ansiosta saadaan aikaan selkeä normaalien ja mutanttien alleelien elektroforeettinen erottelu ja patologisesti pidentyneen fragmentin tarkka määritys eli taudin DNA-diagnostiikka (kuva 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg "width =" 417 "height =" 110 src = ">

Riisi. neljätoista. Poistodiagnoosi GAG geenissä DYT 1 potilailla, joilla on dopa-riippumaton dystonia (polyakryyliamidigeelielektroforeesi). Kaistat 2,3,6 - sairas; kaistat 1,4,5 - ohjaus. Ohut nuoli osoittaa normaalia alleelia, lihavoitu nuoli osoittaa mutantin lyhyemmän alleelin (kolmen nukleotidin deleetio).

Jos tutkittu DNA-alue on kokonaan osa laajennettua deleetiota, ei tästä deletoidusta alleelista DNA:n PCR-amplifikaatiota tehdä, koska alukehybridisaatiolle ei ole paikkoja. Tässä tapauksessa homotsygoottinen deleetio diagnosoidaan PCR-reaktiotuotteen täydellisen puuttumisen perusteella (DNA-synteesi on mahdotonta molemmista geenikopioista). Heterotsygoottisella deleetiolla on mahdollista havaita normaalista (entistä) alleelista syntetisoitu PCR-tuote, mutta tällaisen mutaation luotettavaa diagnoosia varten on tarpeen käyttää kehittyneempiä DNA-kuvausmenetelmiä, jotka mahdollistavat annoksen arvioimisen. lopullinen PCR-tuote.

Pistemutaatioiden (useimmiten nukleotidisubstituutioiden) havaitsemiseksi tietyissä kohdissa PCR-menetelmää käytetään yhdessä muiden molekyyligeneettisten analyysimenetelmien kanssa. Jos lokalisointipaikka ja oletetun pistemutaation luonne tiedetään tarkasti, tällaisen mutaation kohdennettu havaitseminen restriktioendonukleaasit (restriktioentsyymit) - erityiset soluentsyymit, jotka erittyvät erilaisista bakteerikannoista.

Nämä entsyymit tunnistavat spesifisiä nukleotidisekvenssejä, joiden pituus on neljästä kymmeneen nukleotidia. Suorita sitten näiden sekvenssien restriktio (lat. (leikkaus)) osana kaksijuosteista DNA-molekyyliä. Jokainen restriktioentsyymi tunnistaa ja leikkaa kiinteässä paikassa tiukasti määritellyn, itselleen spesifisen nukleotidisekvenssin - rajoituspaikka (tunnistuspaikka).

Tapauksissa, joissa pistemutaatio muuttaa luonnollisen tunnistuskohdan tietylle restriktioentsyymille, tämä entsyymi ei pysty katkaisemaan mutantti-PCR-monistettua fragmenttia. Joissakin tapauksissa mutaatio johtaa uuden tunnistuskohdan ilmestymiseen tietylle restriktioentsyymille, joka puuttuu normista.

Molemmissa tilanteissa valitulla restriktioendonukleaasilla käsitellyt mutantti- ja normaalit PCR-tuotteet tuottavat eripituisia restriktiofragmentteja, jotka voidaan helposti havaita elektroforeesilla (kuvio 15).

Jos siis on tarpeen havaita nopeasti jokin tietty pistemutaatio, tehtävä rajoittuu vastaavan restriktioentsyymin etsimiseen, jonka tunnistuskohta sijaitsee häiriintyneen nukleotidisekvenssin kohdassa. PCR-tuotteiden prosessointi tällaisella restriktioentsyymillä tekee helpoksi erottaa normaalit ja mutanttialleelit. Restriktioanalyysi yksinkertaistaa huomattavasti tunnettujen pistemutaatioiden havaitsemista ja sitä käytetään nykyään laajalti perinnöllisten sairauksien suorassa DNA-diagnostiikassa.

Viimeinen vaihe mutaatioiden molekyyligeneettinen analyysi on tutkitun DNA-fragmentin nukleotidisekvenssin määrittäminen (sekvensointi), jota verrataan normiin ja muotoillaan lopullinen geneettinen diagnoosi. Molekyyligenetiikan menestyksen ansiosta DNA-diagnostiikan menetelmiä on nyt kehitetty yli 400 perinnölliseen sairauteen.

Riisi. 15. Pistemutaatioiden havaitseminen restriktioanalyysillä: A - monistettava geenialue, joka sisältää restriktiokohdanAGCTrestriktioendonukleaasiinAlu minä... MutaatioG→ Amuuttaa tätä nukleotidisekvenssiä, mikä johtaa restriktioentsyymiinAluItukossa; B - restriktiotuotteiden elektroforegrammi: kaista 1 - homotsygoottisuus normaalille alleelille; kaista 2, mutaatiohomotsygoottisuus; kaista 3 - heterotsygoottinen tila (normaali alleeli + mutaatio).

Perinnöllisten sairauksien diagnostiikka, joka perustuu suoraan mutanttialleelien tutkimukseen potilailla, heidän perheenjäsenillään tai epäillyillä heterotsygoottisilla patologisten mutaatioiden kantajilla, soveltuu pre-symptomaattiseen ja synnytystä edeltävään diagnostiikkaan, jota voidaan käyttää sikiön varhaisimmissa kehitysvaiheissa, ennen kliinisiä tai biokemiallisia oireita ilmaantuu sairaus.

Huolimatta mutaatioiden havaitsemismenetelmästä, kunkin mutaation tarkat molekyyliominaisuudet voidaan saada vain suoralla sekvensoinnilla. Tämän prosessin automatisoimiseksi viime vuosina on käytetty laajalti erikoislaitteita - sekvenssereitä, jotka mahdollistavat DNA-tietojen lukemisen merkittävästi nopeuttamisen.

Tie molekyylibiologisen tutkimuksen laajemmalle soveltamiselle kliinisissä diagnostisissa laboratorioissa avaa analyyttisen prosessin kiihtymisen johtuen kaikkien toimenpiteiden suorittamisesta samassa jatkumossa ilman näytteen siirtoa, olosuhteiden luomisen kontaminaation estämiseksi rinnakkaistutkimuksen aikana. analyyttien lukumäärää ja tulosten objektiivista rekisteröintiä kussakin syklissä.

PCR-menetelmän perusmuunnoksia

Käytetään tunnettujen geenimutaatioiden nopeaan skannaukseen.

Multipleksinen (monialuke) PCR

Tämä menetelmä perustuu tutkittavan geenin useiden eksonien samanaikaiseen monistumiseen yhdessä reaktiossa. Tämä mahdollistaa kustannustehokkaan nopean yleisimpien mutaatioiden seulonnan. Esimerkiksi dystrofiinigeenin deleetioiden kuljettamisen nopeaksi diagnosoimiseksi potilailla, joilla on etenevä Duchenne/Becker-lihasdystrofia, sarja tämän geenin yleisimmin mutatoituneita eksoneja monistetaan samanaikaisesti. Koska nämä sairaudet periytyvät X-kytketyn resessiivisen tyypin mukaan ja ne liittyvät yhden X-kromosomin vaurioitumiseen pojilla, reaktiotuotteiden elektroforeesin aikana tapahtuvan pidennetyn deleetion tapauksessa yhden tai useamman DNA-fragmentin puuttuminen ( eksonit) paljastetaan, mikä voi toimia diagnoosin molekyylivahvistuksena. Lisäksi valitsemalla geenin tietyt alueet PCR-monistusta varten on mahdollista saada melko tarkka arvio deleetio- ja geenin hajoamispisteiden kokonaispituudesta (lihasta eksoniin).

Useiden multipleksireaktioiden yhdistetty käyttö mahdollistaa jopa 98 % kaikista deleetioista, joita esiintyy potilailla, joilla on etenevä Duchennen/Beckerin lihasdystrofia. Tämä on noin 60 % dystrofiinigeenin tunnettujen mutaatioiden kokonaismäärästä ja osoittaa tämän seulontamenetelmän erittäin korkeaa tehokkuutta dystrofinopatioiden DNA-diagnostiikassa (kuvio 16).

Riisi. 16. Duchennen lihasdystrofian suora DNA-diagnoosi moninkertaisella PCR:llä (agaroosigeelielektroforeesi). Jokaisessa tutkitussa yksilössä dystrofiinigeenin neljä eksonia monistettiin samanaikaisesti (eksonit 17, 19, 44 ja 45; nuolet osoittavat vastaavat monistustuotteet). Kaista 1 - kontrolli, kaistat 2-5 - potilaat, joilla on Duchennen lihasdystrofia, joissa on erilaisia ​​dystrofiinigeenin deleetioita (kaistat 2 ja 5 - eksonin 45 deleetio, kaista 3 - eksonin 44 deleetio, kaista 4 - eksonien 17 ja 19 deleetio ).

Alleelispesifinen vahvistus

Menetelmä perustuu kahden riippumattoman alukeparin käyttöön geenin tietylle alueelle: yksi aluke molemmissa pareissa on yhteinen, ja toisella alukkeella kussakin parissa on erilainen rakenne ja se on komplementaarinen joko normaalille tai mutantille DNA:lle. järjestys. Tällaisen reaktion tuloksena kahden tyyppisiä PCR-tuotteita, normaaleja ja mutantteja, voidaan syntetisoida samanaikaisesti liuoksessa. Lisäksi käytettyjen alukkeiden suunnittelu mahdollistaa selkeän eron normaalien ja mutanttien monistustuotteiden välillä niiden molekyylikoon perusteella. Tämä menetelmä on hyvin havainnollistava ja antaa sinun varmistaa mutanttialleelin sekä homo- että heterotsygoottisen kantamisen.

Menetelmä monistetun DNA:n kohdistettuun modifiointiin

Menetelmä perustuu ns. mismatch-alukkeen käyttöön PCR:ssä (ei täysin komplementaarinen templaatille), joka eroaa templaatti-DNA-sekvenssistä yhdellä nukleotidilla. Tämän alukkeen sisällyttämisen seurauksena mutantti-PCR-tuotteen koostumukseen muodostuu siihen keinotekoisesti luotu restriktiokohta yhdelle restriktioendonukleaasille, mikä mahdollistaa tietyn tunnetun mutaation suoran DNA-diagnostiikan restriktioanalyysin avulla. Tällaisen keinotekoisen restriktiokohdan luominen on joskus tarpeen, jos haku ei paljastanut tunnetun ja saatavilla olevan entsyymin olemassaoloa, jonka "luonnolliseen" restriktiokohtaan vaikuttaa tutkitun mutaation ilmaantuminen DNA-molekyyliin. .

Käänteistranskriptaasi PCR (RT- PCR)

Tätä menetelmää käytetään tapauksissa, joissa on kätevämpää käyttää tutkimuskohteena ei genomista DNA:ta, vaan kompaktimpaa ja tiedollisesti "rikkaampaa" cDNA:ta, joka on saatu kudosnäytteiden, esimerkiksi biopsiamateriaalin tai lymfosyyttisolulinjojen, asianmukaisen käsittelyn jälkeen, fibroblastit jne. Tärkeä ehto tässä on halutun geenin ilmentyminen (ainakin minimaalinen) tutkittavassa kudoksessa.

Ensimmäisessä vaiheessa suoritetaan mRNA:n käänteistranskriptio, ja saadut cDNA-molekyylit toimivat templaattina PCR:lle. Tämän jälkeen cDNA:n kriittiselle alueelle, joka on monistettu riittävässä määrin, suoritetaan sekvensointi ja muut mutaatioseulontamenetelmät, suora elektroforeettinen tutkimus (deleetioiden, insertioiden jne. havaitseminen) tai insertio ekspressiojärjestelmään proteiinituotteen ja sen saamiseksi. suora analyysi.

Tämä menetelmä on erityisen tehokas "typistetyn" proteiinin synteesiin johtavien mutaatioiden havaitsemiseen (nonsense-mutaatiot, silmukointimutaatiot, suuret deleetiot) - niin kutsuttu PTT-analyysi (Protein Truncation Test). PTT-määritystä käytetään yleisesti laajennettujen monieksonigeenien, kuten Duchenne/Beckerin lihasdystrofiageenin, ataksia-telangiektasian tai tyypin 1 neurofibromatoosin, tutkimuksessa.

Reaaliaikainen PCR(Reaaliaikainen PCR)

Joka vuosi käytännön terveydenhuollossa reaaliaikaisesta PCR:stä on tulossa yhä suositumpi diagnostinen menetelmä. Sen pääominaisuus on pkertymisen seuranta ja kvantitatiivinen analyysi sekä saatujen tulosten automaattinen rekisteröinti ja tulkinta. Tämä menetelmä ei vaadi elektroforeesivaihetta, mikä mahdollistaa PCR-laboratorion vaatimusten vähentämisen. Tuotantotilan taloudellisuuden, henkilöstömäärän vähenemisen ja DNA/RNA:n kvantitatiivisen määrityksen kysynnän vuoksi tätä menetelmää on käytetty viime vuosina menestyksekkäästi kehittyneiden maiden suurimmissa terveys-epidemioissa, diagnostisissa ja tutkimuskeskuksissa. PCR:n nykyisessä ("klassisessa") muodossaan.

Reaaliaikainen PCR käyttää fluoresoivasti leimattuja oligonukleotidikoettimia DNA:n havaitsemiseen sen monistamisen aikana. Reaaliaikainen PCR mahdollistaa näytteen täydellisen analyysin 20-60 minuutissa ja pystyy teoriassa havaitsemaan jopa yhden DNA- tai RNA-molekyylin näytteestä.

Riisi. 17. Reaaliaikainen PCR.

Reaaliaikainen PCR käyttää TaqMan-järjestelmää, joka tarkkailee PCR:n kinetiikkaa suoraan monistuksen aikana favulla. Detektioon käytetään koetinta, jossa on fluorofori ja sammuttaja, jotka ovat komplementaarisia monistetun fragmentin keskiosalle. Kun fluorofori ja sammuttaja on sidottu oligonukleotidikoettimeen, havaitaan vain merkityksetöntä fluoresenssiemissiota. Monistusprosessin aikana Taq-polymeraasin 5'-eksonukleaasiaktiivisuuden vuoksi fluoresoiva leima siirtyy liuokseen, vapautuen sammuttimen läheisyydestä ja muodostaa fluoresoivan signaalin, joka vahvistuu reaaliajassa suhteessa solujen kertymiseen. amplifikaatti (kuva 17).

PCR-Real-Time tärkeimmät edut PCR:ään verrattuna geelielektroforeesilla:

· Koko menetelmä tapahtuu yhdessä koeputkessa;

· Menetelmä kestää 1 tunnin;

· Tarpeeksi 1-2 työhuonetta;

· Tuloksen kvalitatiivisen arvioinnin ohella on mahdollista arvioida kvantitatiivisesti (esim. AIDSin tai virushepatiitin viruslääkitystä määrättäessä on tiedettävä viruskuorma eli viruksen määrä yksikköä kohti, joka tarjoaa reaaliaikaisen PCR:n);

· Saastumisriski pienenee jyrkästi.

Johtopäätös

PCR-menetelmä on yksi yleisimmistä molekyylibiologisen tutkimuksen menetelmistä. Kliinikoiden tulee käyttää tätä menetelmää tarkoituksenmukaisesti, ja lääkärillä, joka päättää käyttää PCR:ää työssään, tulee olla jonkin verran tietoa tämän menetelmän ominaisuuksista ja ominaisuuksista. Toiseksi kliinikon ja PCR-laboratorion välillä on oltava tiivistä palautetta monimutkaisten tapausten analysoimiseksi ja oikean diagnoosistrategian kehittämiseksi. Kolmanneksi PCR-analyysi ei ole ihmelääke diagnoosissa (ensisijaisesti tartuntatautien) eikä korvaa olemassa olevia tutkimusmenetelmiä, vaan vain täydentää niitä. Ja mikä tärkeintä, PCR ei voi korvata intuitiota ja analyyttistä ajattelua, joka menestymiseen luottavalla lääkärillä pitäisi olla.

P . S ... Molekyylibiologinen tutkimus - muutos diagnostisissa ja hoitosuosituksissa. Mahdollisuus radikaaliin painopisteen muutokseen laboratoriodiagnostiikassa liittyy molekyylibiologisten menetelmien käyttöön. Emme voi puhua vain oikea-aikaisesta tiedosta, vaan sen saamisesta etukäteen. Jos nyt laboratoriotutkimuksia tehdään useimmiten jo kehittyneen taudin kanssa ja hoito on aloitettu, niin molekyylibiologisen laboratoriotiedon odotetaan mahdollistavan henkilön taipumuksen tietyntyyppisiin patologioihin ja herkkyyden tietyille lääkkeille paljastamisen, joka oikeuttaa ennakoivan, ennaltaehkäisevän ja yksilöllisen tulevaisuuden lääketieteen luonteen.

DIAGNOSTIIKKA- JA HOITOLINJIEN VAIHTO

PERINNÄLLISET SAIraudet

Tänään Tulevaisuudessa

Diagnoosi Geneettinen passi

8. Kuinka monta työhuonetta tarvitaan PCR-laboratorioon, jossa on fluoresenssin havaitseminen (kvantitatiivinen analyysi, Real-Time PCR)?

9. Mitä havaitseminen on?

10. Mitä DNA-diagnostiikan menetelmiä erotetaan?

11. Mikä entsyymi on PCR:n perusta?

12. Miksi havaintoalue tulisi poistaa muista työalueista?

13. Mikä on rajoitussivusto?

14. Mitä eroa on suoralla DNA-diagnostiikan menetelmällä ja epäsuoralla?

15. Mitä sekvensointi on?

16. Mikä on multipleksinen PCR?

17. Minkä tyyppiset mutaatiot määritetään PCR:llä?

18. Mitä on kontaminaatio?

19. Mikä on alleelispesifisen amplifikaatiomenetelmän ydin?

20. PCR-materiaalin säilytysolosuhteet?

21. Missä laitteessa vahvistus tapahtuu?

22. Mikä on käänteistranskriptaasi-PCR (RT-PCR) -menetelmä?

23. Mikä on PCR-diagnostiikan materiaali?

24. Luettelo kontaminaatiotyypit?

Itseopiskelutestit

1. Endonukleaasirestriktioentsyymit:

a) entsyymit, jotka "murtavat" DNA:ta tiukasti määrätyissä paikoissa;

b) entsyymit, jotka sillottavat DNA-molekyylin katkeamista;

c) entsyymit, jotka tuottavat yhdisteitä, jotka suorittavat DNA:n korjauksen.

2. Geenien monistus:

3. Mitä molekyyligenetiikan menetelmistä käytetään tunnetun sekvenssin mukaisen mutanttigeenin aiheuttamien sairauksien diagnosointiin?

a) tietyn restriktioentsyymin käyttö;

b) suora havaitseminen käyttämällä spesifisiä molekyylikoettimia;

c) normaalin restriktiofragmentin pituuden polymorfismin jakautumisen perheanalyysi.

4. DNA-sekvensointi:

a) DNA-emässekvenssin tunnistaminen;

b) DNA-palan moninkertainen toisto;

c) tutkittavan geenin sisältävän DNA-fragmentin eristäminen.

5. DNA-näytteiden saamiseksi voit käyttää :

b) korionivilli;

c) lapsivesi;

d) lapsivesisolut;

e) biopsiat ihosta, lihaksista, maksasta,

f) kaikki on oikein, paitsi kohta "c",

g) kaikki on oikein, paitsi kohta "d",

h) kaikki yllä oleva pitää paikkansa.

6. PCR-menetelmää käyttävien mutaatioiden diagnosoimiseksi:

a) genominen;

b) kromosomaalinen;

c) geeni (piste).

7. Pohja on:

a) komplementaarinen DNA-alue;

b) synteettinen oligonukleotidileimattu (radioaktiivinen tai fluoresoiva) sekvenssi, joka on komplementaarinen mutantti- tai normaaligeenille;

c) oligonukleotidi, joka toimii "siemenenä" ja käynnistää polynukleotidiketjun synteesin DNA- tai RNA-templaatissa.

8. Kuka kehitti PCR-menetelmän periaatteen?

b) K. Mullis

9. Käytetäänkö PCR-menetelmää trinukleotiditoistojen (dynaamisten mutaatioiden) laajenemisen diagnosoimiseen?

10. Millä alueilla PCR:ää käytetään?

a) kliininen lääketiede;

b) siirtogeenisten organismien (GMO) määrittäminen

c) henkilöllisyystodistus, isyys, oikeuslääketieteen tutkimus

d) kaikki edellä mainitut,

e) ei mikään yllä olevista..

Esimerkkivastaukset: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - c; 7 - c; 8 - b; 9 - a, 10 - d.

Pää

1. Barrels genetics. Moskova. GEOTAR, 2002.

Lisätiedot

1., Bakharev ja lasten synnynnäisten ja perinnöllisten sairauksien hoito. - Moskova, 2004.

2. DNA-diagnostiikka ja lääketieteellinen geneettinen neuvonta. - Moskova, 2004.

3. Gintergenetiikka. - Moskova, 2003.

4. Gorbunov Lääketieteellisen genetiikan perusteet. - SPb .: Intermedica, 1999.

5. Herrington S., J. McGee. Molekyylikliininen diagnostiikka. - Rauha, 1999.

6. Menshikov - kliinisen laboratoriodiagnostiikan biologinen tutkimus: ongelman mahdollisuudet (luennot). Kliininen laboratoriodiagnostiikka, nro 3, 2006.

7. Kornienko PCR-laboratorion työ biologisen materiaalin virtausanalyysissä. Kliininen laboratoriodiagnostiikka, nro 10, 2006.

8. PCR-laboratorion työn organisointi. Menetelmäohjeet. MU 1.3.1794-03. Venäjän federaation johtava terveyslääkäri, 2003.

9. Erlich H. A. PCR-tekniikka. - Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR. Genome Res. - Nro 6, 1996.

MENETELMÄN PERUSPERIAATTEET

POLYMERAASI KETJUREAKTIO

Menetelmäkäsikirja yleislääketieteen (060101) ja pediatrian (060103) erikoisalojen 3-4-vuotiaiden opiskelijoiden opetuksen ulkopuoliseen työhön.

GOU VPO "liittovaltion terveydenhuollon ja sosiaalisen kehityksen viraston Krasnojarskin valtion lääketieteellinen akatemia"

Venäjä, Krasnojarsk,

Monien tartuntatautien riittävän ja tehokkaan hoidon kannalta on tarpeen tehdä oikea-aikainen diagnoosi. Tämän ongelman ratkaisemisessa mukana ovat nykyään korkean teknologian diagnostiset menetelmät, jotka perustuvat molekyylibiologian menetelmiin. Tällä hetkellä polymeraasiketjureaktiota (PCR) käytetään jo laajasti käytännön lääketieteessä luotettavimpana laboratoriodiagnostiikan välineenä.

Mikä selittää PCR:n suosion tällä hetkellä?

Ensinnäkin tätä menetelmää käytetään erilaisten tartuntatautien aiheuttajien tunnistamiseen suurella tarkkuudella.

Toiseksi seurata hoidon tehokkuutta.

Erilaisissa käsikirjoissa, esitteissä, artikkeleissa sekä erikoislääkäreiden selityksissä törmäämme usein käsittämättömien termien ja sanojen käyttöön. Tieteen korkean teknologian tuotteista on todella vaikea puhua tavallisin sanoin.

Mikä on PCR-diagnostiikan ydin ja mekaniikka?

Jokaisella elävällä organismilla on omat ainutlaatuiset geeninsä. Geenit sijaitsevat DNA-molekyylissä, joka itse asiassa on kunkin organismin "käyntikortti". DNA (geneettinen materiaali) on erittäin pitkä molekyyli, joka koostuu nukleotideiksi kutsutuista rakennuspalikoista. Jokaiselle tartuntatautien aiheuttajalle ne sijaitsevat tiukasti spesifisesti, eli tietyssä järjestyksessä ja yhdistelmässä. Kun on tarpeen ymmärtää, onko henkilöllä jokin tietty taudinaiheuttaja, otetaan biologista materiaalia (veri, virtsa, sylki, sivelynäyte), joka sisältää mikrobin DNA:ta tai DNA-fragmentteja. Mutta patogeenin geneettisen materiaalin määrä on hyvin pieni, ja on mahdotonta sanoa, mihin mikro-organismiin se kuuluu. Tämän ongelman ratkaisemiseksi käytetään PCR:ää. Polymeraasiketjureaktion ydin on, että DNA:ta sisältävää tutkimusmateriaalia otetaan pieni määrä ja PCR-prosessin aikana tiettyyn taudinaiheuttajaan kuuluvan geneettisen materiaalin määrä lisääntyy ja siten se voidaan tunnistaa.

PCR-diagnostiikka on biomateriaalin geneettinen tutkimus.

PCR-menetelmän idea kuuluu amerikkalaiselle tiedemiehelle K. Mullinsille, jonka hän ehdotti vuonna 1983. Se sai kuitenkin laajan kliinisen käytön vasta XX vuosisadan 90-luvun puolivälissä.

Selvitetään terminologia, mikä se on - DNA jne. Jokaisen elävän olennon (eläin, kasvi, ihminen, bakteeri, virus) jokaisessa solussa on kromosomit. Kromosomit ovat geneettisen tiedon säilyttäjiä, jotka sisältävät kunkin elävän olennon koko geenisekvenssin.

Jokainen kromosomi koostuu kahdesta DNA-juosteesta, jotka on kierretty kierteeksi suhteessa toisiinsa. DNA on kemiallisesti deoksiribonukleiinihappoa, joka koostuu rakenteellisista komponenteista - nukleotideista. Nukleotideja on 5 tyyppiä - tymiini (T), adenosiini (A), guaniini (G), sytosiini (C) ja urasiili (U). Nukleotidit sijaitsevat peräkkäin tiukassa yksittäisessä sekvenssissä muodostaen geenejä. Yksi geeni voi koostua 20-200 tällaisesta nukleotidistä. Esimerkiksi insuliinin tuotantogeeni on 60 emäsparin pituinen.

Nukleotideilla on komplementaarisuuden ominaisuus. Tämä tarkoittaa, että adeniinia (A) vastapäätä toisessa DNA-juosteessa on välttämättä tymiiniä (T) toisessa juosteessa ja vastapäätä guaniinia (G) - sytosiini (C). Se näyttää kaavamaisesti tältä:
G-C
T-A
A-T
Tämä täydentävyysominaisuus on avain PCR:lle.

DNA:n lisäksi RNA:lla on sama rakenne - ribonukleiinihappo, joka eroaa DNA:sta siinä, että se käyttää urasiilia tymiinin sijaan. RNA - on joidenkin retroviruksiksi kutsuttujen virusten (esimerkiksi HIV) geneettisen tiedon säilyttäjä.

DNA- ja RNA-molekyylit voivat "lisätä" (tätä ominaisuutta käytetään PCR:ssä). Se tapahtuu seuraavasti: kaksi DNA- tai RNA-juostetta siirtyy erilleen toisistaan, jokaisessa juosteessa istuu erityinen entsyymi, joka syntetisoi uuden juosteen. Synteesi etenee komplementaarisuuden periaatteen mukaisesti, eli jos alkuperäisessä DNA-juosteessa on nukleotidi A, niin vasta syntetisoidussa on T, jos G - niin C jne. Tämä erityinen entsyymi - "rakentaja" synteesin alkuun tarvitsee "siemenen" - 5-15 nukleotidin sekvenssin. Tämä "siemen" on määritelty jokaiselle geenille (klamydiageeni, mykoplasma, virukset) kokeellisesti.

Joten jokainen PCR-sykli koostuu kolmesta vaiheesta. Ensimmäisessä vaiheessa tapahtuu ns. DNA:n purkaminen eli kahden linkitetyn DNA-juosteen erottaminen. Toisessa "siemen" on kiinnitetty DNA-juosteen osaan. Ja lopuksi näiden DNA-säikeiden pidentäminen, jonka "rakentaja"-entsyymi tuottaa. Tällä hetkellä koko tämä monimutkainen prosessi tapahtuu yhdessä koeputkessa ja koostuu määritetyn DNA:n toistuvista toistosykleistä, jotta saadaan suuri määrä kopioita, jotka voidaan sitten havaita tavanomaisilla menetelmillä. Eli yhdestä DNA-juosteesta saamme satoja tai tuhansia.

PCR-tutkimuksen vaiheet

Biologisen materiaalin kokoelma tutkimusta varten

Näytteenä käytetään erilaisia ​​biologisia materiaaleja: verta ja sen komponentteja, virtsaa, sylkeä, limakalvovuotoa, aivo-selkäydinnestettä, eritettä haavan pinnoilta ja ruumiinonteloiden sisältöä. Kaikki biotestit kerätään kertakäyttöisillä instrumenteilla ja kerätty materiaali suljetaan muovisiin steriileihin putkiin tai asetetaan viljelyalustaan, minkä jälkeen se kuljetetaan laboratorioon.

Tarvittavat reagenssit lisätään kerättyihin näytteisiin ja asetetaan ohjelmoitavaan termostaattiin - lämpökiertolaitteeseen (vahvistimeen). Vahvistimessa PCR-sykli toistetaan 30-50 kertaa, ja se koostuu kolmesta vaiheesta (denaturaatio, hehkutus ja elongaatio). Mitä tämä tarkoittaa? Katsotaanpa tarkemmin.

Suoran PCR-reaktion vaiheet, geneettisen materiaalin kopiointi

minäPCR-vaihe - Geneettisen materiaalin valmistelu kopiointia varten.
Se tapahtuu 95 ° C: n lämpötilassa, kun taas DNA-säikeet erotetaan ja "siemenet" voivat istua niissä.

"Siemeniä" valmistavat teollisesti eri tutkimus- ja tuotantoyhdistykset ja laboratoriot ostetaan valmiina. Samaan aikaan esimerkiksi klamydian havaitsemiseen tarkoitettu "siemen" toimii vain klamydian jne. Siten, jos biomateriaalia testataan klamydiainfektion esiintymisen varalta, reaktioseokseen laitetaan klamydian "siemen"; jos biomateriaali testataan Epstein-Barr-viruksen varalta, se on myös Epstein-Barr-viruksen "siemen".

IIvaihe - Yhdistetään tartunnanaiheuttajan ja "siemenen" geneettinen materiaali.
Jos havaitun viruksen tai bakteerin DNA:ta on, "siemen" on tämän DNA:n päällä. Tämä "alukkeen" kiinnitysprosessi on PCR:n toinen vaihe. Tämä vaihe tapahtuu 75 °C:n lämpötilassa.

IIIvaihe - Kopioidaan tartunnanaiheuttajan geneettinen materiaali.
Tämä on geneettisen materiaalin pidentymis- tai lisääntymisprosessi, joka tapahtuu 72 °C:ssa. "Rakennusentsyymi" lähestyy "siemeniä" ja syntetisoi uuden DNA-juosteen. Uuden DNA-juosteen synteesin päättyessä myös PCR-sykli päättyy. Eli yhdessä PCR-syklissä geneettisen materiaalin määrä kaksinkertaistuu. Esimerkiksi alkuperäisessä näytteessä oli 100 minkä tahansa viruksen DNA-molekyyliä, ensimmäisen PCR-syklin jälkeen näytteessä on jo 200 testatun viruksen DNA-molekyyliä. Yksi sykli kestää 2-3 minuuttia.

Riittävän määrän geneettistä materiaalia tunnistusta varten tuotetaan yleensä 30-50 PCR-sykliä, joka kestää 2-3 tuntia.

Lisätyn geneettisen materiaalin tunnistamisvaihe

Itse PCR päättyy tähän, ja sitten on yhtä merkittävä tunnistusvaihe. Tunnistamiseen käytetään elektroforeesimenetelmää tai merkittyjä "alukkeita". Elektroforeesia käytettäessä saadut DNA-säikeet erotetaan koon mukaan, ja eripituisten DNA-fragmenttien läsnäolo osoittaa positiivisen analyysituloksen (eli tietyn viruksen, bakteerin jne. läsnäoloa). Merkittyjä "alukkeita" käytettäessä lopulliseen reaktiotuotteeseen lisätään kromogeenia (väriainetta), minkä seurauksena entsymaattiseen reaktioon liittyy värin muodostuminen. Värin kehittyminen osoittaa suoraan, että alkuperäisessä näytteessä on virus tai muu havaittava aine.

Nykyään käyttämällä merkittyjä "alukkeita" sekä asianmukaista ohjelmistoa on mahdollista "lukea" välittömästi PCR:n tulokset. Tämä on niin kutsuttu reaaliaikainen PCR.

Miksi PCR-diagnostiikka on niin arvokasta?

Yksi PCR-menetelmän merkittävistä eduista on sen korkea herkkyys - 95 - 100%. Näiden etujen tulisi kuitenkin perustua seuraavien ehtojen välttämättömään noudattamiseen:

1. biologisen materiaalin oikea keräys, kuljetus;
2. steriilien, kertakäyttöisten instrumenttien, erityisten laboratorioiden ja koulutetun henkilöstön saatavuus;
3. tekniikan ja steriiliyden tiukka noudattaminen analyysin aikana

Herkkyys vaihtelee eri havaittujen mikrobien välillä. Esimerkiksi PCR-menetelmän herkkyys C-hepatiittiviruksen havaitsemiseksi on 97-98 %, herkkyys ureaplasman havaitsemiseksi on 99-100 %.

PCR-analyysin luontaiset ominaisuudet mahdollistavat lyömättömän analyyttisen spesifisyyden saavuttamisen. Tämä tarkoittaa etsimäsi mikro-organismin tunnistamista, ei samankaltaista tai läheistä sukua olevaa mikro-organismia.
PCR-menetelmän diagnostinen herkkyys ja spesifisyys ovat usein parempia kuin viljelymenetelmän, jota kutsutaan "kultastandardiksi" tartuntatautien havaitsemisessa. Kun otetaan huomioon viljelmän kasvun kesto (useista päivistä useisiin viikkoihin), PCR-menetelmän etu tulee ilmeiseksi.

PCR infektioiden diagnosoinnissa
PCR-menetelmän edut (herkkyys ja spesifisyys) määrittävät laajan valikoiman sovelluksia nykyaikaisessa lääketieteessä.
PCR-diagnostiikan pääasialliset sovellusalueet:

1. eri lokalisaatioiden akuuttien ja kroonisten infektiosairauksien diagnostiikka
2. seurata hoidon tehokkuutta
3. patogeenin tyypin selvittäminen

PCR:ää käytetään synnytystautien, gynekologian, neonatologian, pediatrian, urologian, sukupuolitautien, nefrologian, infektiotautiklinikan, oftalmologian, neurologian, fthisiopulmonologian jne.

PCR-diagnostiikan käyttö tapahtuu muiden tutkimusmenetelmien (ELISA, PIF, RIF jne.) yhteydessä. Niiden yhdistelmän ja tarkoituksenmukaisuuden päättää hoitava lääkäri.

PCR:llä havaitut tartunnanaiheuttajat

Virukset:

1. retrovirukset HIV-1 ja HIV-2
2. herpetiformiset virukset
3. herpes simplex -viruksen tyypit 1 ja 2

Artikkelin sisältö:

Erittäin informatiivinen PCR-menetelmä (polymeraasiketjureaktio) mahdollistaa erilaisten akuuttien tai kroonisten geneettisten ja tartuntatautien varhaisen havaitsemisen. Lisäksi ne voidaan tunnistaa jopa siinä vaiheessa, kun ne eivät ilmene millään oireilla. Useimmiten PCR-analyysiä käytetään sukupuoliteitse tarttuvien infektioiden (STD, STI) havaitsemiseen.

PCR-analyysi viittaa molekyylidiagnostiseen menetelmään, joka perustuu taudinaiheuttajan tiettyjen nukleiinihappofragmenttien (DNA) pienten pitoisuuksien moninkertaiseen lisääntymiseen missä tahansa biologisessa materiaalissa (kohdunkaulan, emättimen, virtsaputken, veren, syljen, ysköksen irtosolunäyte). jne.) ja vertaa sen DNA:ta tai RNA:ta tunnettujen tartuntatautityyppien tietokantaan.

Tekniikan kehitti amerikkalainen Carrie Mullis viime vuosisadan 80-luvulla. Vuonna 1993 tiedemies sai kemian Nobelin palkinnon. Nykyään PCR-tutkimusta pidetään eräänlaisena "kultastandardina" useimpien infektioiden diagnosoinnissa. PCR-analyysiä käytetään laajasti lääketieteellisessä käytännössä taudin luonteen selvittämiseen ja tarkan diagnoosin tekemiseen. Hyvin usein on tapauksia, joissa kaikki tunnetut immunologiset, virologiset ja bakteriologiset menetelmät eivät toimi. Tällöin PCR:stä tulee ainoa tapa tunnistaa taudin aktiivinen vaihe.

PCR-diagnostiikan edut muihin menetelmiin verrattuna

PCR-tekniikka on löytänyt laajan sovelluksen nykyaikaisessa lääketieteessä useiden kiistattomien etujen ansiosta. Puhutaanpa niistä tarkemmin.

Mahdollisuus havaita patogeenin esiintyminen suoraan

Monet perinteiset diagnostiset tekniikat perustuvat merkkiaineiden tunnistamiseen - proteiinien, jotka ovat taudin aiheuttajan aineenvaihduntatuotteita. Tämä diagnoosiperiaate voi tarjota vain epäsuoran vahvistuksen patologialle. PCR-menetelmällä voidaan määrittää patogeeni suoraan, koska se tunnistaa patogeenisten organismien DNA:n tietyt alueet.

Korkea spesifisyys

PCR-tekniikka on erittäin spesifinen, koska se mahdollistaa DNA-fragmenttien havaitsemisen, jotka ovat ominaisia ​​vain tietylle tartunta-aineelle. Immunologisia menetelmiä käytettäessä virheellisen tuloksen saamisen todennäköisyys säilyy (diagnoosin virheet liittyvät ristiin reagoiviin antigeeneihin). Mitä tulee PCR:ään, tässä suljetaan pois virheet, koska tässä tapauksessa spesifisyyden määrää alukkeiden nukleotidisekvenssi.

Yliherkkyys

Tällä menetelmällä havaitaan jopa yksittäiset patogeenit. Infektioiden aiheuttajat havaitaan ihmiskehossa silloinkin, kun muut diagnostiset menetelmät eivät selvennä tilannetta (puhumme erilaisista immunologisista mikroskooppisista ja bakteriologisista tutkimusmenetelmistä).

Tässä tiedot vertailua varten. Mikroskooppisten ja immunologisten menetelmien herkkyys on 103-105 solua ja PCR:n herkkyys 10-100 solua näytteessä.

Menetelmän monipuolisuus

PCR-tekniikka perustuu patogeenisten organismien DNA:n tutkimukseen. Tutkimuksen aikana tunnistetaan RNA- tai DNA-fragmentteja, jotka ovat spesifisiä tietyille tartunta-aineille. Koska kaikilla nukleiinihapoilla on samanlainen kemiallinen koostumus, laboratorioanalyysissä voidaan käyttää yhtenäisiä menetelmiä. Tämä tarkoittaa, että yhden näytteen tutkiminen mahdollistaa useiden patogeenien tunnistamisen kerralla.

Nopeat tulokset

Tämä tekniikka ei vaadi patogeeniviljelmien viljelyä, mikä kestää melko kauan. Yhtenäisen materiaalinkäsittelyteknologian ja reaktiotuotteiden havaitsemisen sekä automatisoidun monistusprosessin ansiosta koko tutkimusprosessi vie vain muutaman tunnin.

Mahdollisuus havaita infektiot piilevässä muodossa

PCR-tekniikalla voidaan suorittaa tehokkaasti prekliinistä diagnostiikkaa (patogeenien tunnistaminen ennen oireiden ilmaantumista) ja retrospektiivistä diagnostiikkaa (patogeenien määritys menneen sairauden jälkeen). Joten prekliinisellä diagnostiikalla on suuri merkitys tutkittaessa potilasta mahdollisen taudin itämisaikana - väitetyn infektion jälkeen ennen ensimmäisten merkkien ilmaantumista.

Yksi PCR:n tärkeistä eduista on mahdollisuus käyttää sitä biologisten jäämien tai arkistomateriaalien analysointiin. Tämä mahdollistaa isyyden ja henkilöllisyyden tunnistamisen.

Nykyään PCR-diagnostiikkamenetelmien kehitys jatkuu. Itse analyysitekniikkaa parannetaan ja uusia PCR-tyyppejä ilmestyy. Tämän reaktion innovatiiviset testijärjestelmät otetaan käyttöön lääketieteellisessä käytännössä. Tieteen nopean kehityksen ansiosta toimenpiteen kustannukset ovat laskemassa, ja nyt PCR-tutkimusta voidaan käyttää useille potilasryhmille.

Tämä diagnostinen menetelmä perustuu tietyn RNA- tai DNA-osan moninkertaiseen kaksinkertaistamiseen. Tämä prosessi suoritetaan laboratoriossa erityisillä entsyymeillä. Tämän seurauksena muodostuu niin monta DNA:ta (RNA:ta) kuin tarvitaan visuaalista tarkastelua varten. Toimenpiteen aikana kopioidaan vain määritettyjä olosuhteita vastaava alue (jos se on tutkittavassa näytteessä).

Biologinen materiaali, joka on tutkittava DNA- tai RNA-patogeenien esiintymisen varalta, asetetaan vahvistimeen. (Tilauksesta riippuen analysoitavaksi otetaan verta, virtsaa, sylkeä, erotettuna sukuelimistä). Sitten näytteisiin lisätään erityisiä entsyymejä. Ne sitoutuvat patogeenisten mikrobien RNA:han tai DNA:han ja kopiosynteesi alkaa. Kopiointi on monivaiheinen prosessi, joka etenee ketjureaktion tyypin mukaan. Tämän seurauksena saattaa ilmestyä satoja tai jopa tuhansia kopioita.

Diagnostiikan seuraavassa vaiheessa tulokset analysoidaan ja verrataan tartuntatautien aiheuttajatietokantaan.

PCR-tekniikka ei vain mahdollista patogeenisen organismin tyypin määrittämistä, vaan antaa myös mahdollisuuden tehdä johtopäätöksiä tartunta-aineiden määrästä ihmiskehossa.
Nykyään tällaisten teknologioiden käyttö avaa laajoja mahdollisuuksia mutaatioiden ja DNA-osien silmukoinnin tutkimuksessa. Nykyaikaisessa lääketieteessä menetelmää alettiin käyttää isyyden määrittämiseen, uusien geenien tunnistamiseen ja paljon muuta.

Monipuolisuutensa ansiosta PCR-menetelmä on löytänyt laajan sovelluksen urologiassa, gynekologiassa, keuhkotologiassa, onkologiassa, hematologiassa, ftisiologiassa, infektiotautikäytännössä ja muilla lääketieteen aloilla.

Materiaali PCR-analyysiin

PCR-diagnostiikassa käytetään erilaisia ​​ihmiskehosta otettuja biologisia väliaineita ja nesteitä: ysköstä, limaa, sylkeä, virtsaa, verta, epiteelisolujen raapimista, istukan kudosta, keuhkopussin nestettä, lapsivettä, eturauhasen mehua jne.

Sukupuolitautia (STI) diagnosoitaessa analysoidaan eritteitä miehen ja naisen sukupuolielimistä. Tätä varten virtsaputkesta tai kohdunkaulasta tehdään sively tai kaavinta. Myös virtsaa käytetään tutkimukseen.

Infektioiden (herpes, mononukleoosi, CMVI, toksoplasmoosi, HIV, hepatiitti B ja C) havaitsemiseksi otetaan verta analyysiä varten. Jos hermoston vauriota epäillään, otetaan aivo-selkäydinnestettä.

Keuhkotutkimuksissa käytetään keuhkopussin nestettä ja ysköstä.

Kohdunsisäisten infektioiden havaitsemiseksi analysoidaan istukan kudos ja lapsivesi.

PCR sukupuolitautien ja muiden infektioiden varalta

Mitä infektioita voidaan havaita PCR-analyysillä?

HIV-infektio (HIV-1 ihmisen immuunikatovirus voidaan havaita).

Virushepatiitti A, B, C, G (RNA-HAV, DNA-HBV, RNA-HCV, RNA-HGV).

Sukupuolitaudit (sukupuolitaudit) - ureaplasmoosi, gardnerelloosi, klamydia, mykoplasmoosi, trikomoniaasi.

Tarttuva mononukleoosi (Epstein-Barr-EBV-viruksen DNA).

Sytomegalovirusinfektio (DNA-CMV).

Herpes-infektio (DNA-herpes simplex -viruksen HSV-tyypit 1 ja 2).

Tuberkuloosi (Mycobacterium tuberculosis).

Onkogeeniset virukset - ihmisen papilloomavirusinfektio (ihmisen papilloomavirus (mukaan lukien sen onkogeeniset tyypit 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 ja 59).

Borrelioosi, puutiaisaivotulehdus.

Listerioosi.

Candidiasis (Candida-suvun sienet).

Helicobacter pylori -infektio
muu.

PCR-analyysin valmistelu ja toimitus

Potilaat, jotka ovat toimittaneet materiaalia PCR-diagnostiikkaan, odottavat saavansa nopean ja tarkan tuloksen. Samalla on otettava huomioon yksi tärkeä seikka - diagnoosin luotettavuus ei riipu vain asiantuntijoiden ammattitaidosta ja lääketieteellisen laboratorion kyvyistä. Jotta tutkimus olisi informatiivinen, potilaan on itse ponnisteltava. Joten on välttämätöntä noudattaa tiukasti kaikkia lääkärin suosituksia ja noudattaa huolellisesti materiaalin keräämiseen valmistautumista koskevia sääntöjä. On erittäin tärkeää välttää biologisten näytteiden kontaminaatiota, muuten testitulokset vääristyvät.

Valmistautuminen PCR-analyysiin

Menettelyn valmisteluun ei liity erityisiä vaikeuksia. Riittää, kun muistat muutaman säännön:

Veri PCR-analyysiä varten annetaan tyhjään mahaan. Veri otetaan suoneen, yleensä aamulla steriilillä neulalla, erityiseen astiaan.

Aineen ottamista edeltävänä päivänä seksuaalista pidättymistä ilmenee otettaessa sukupuolitautien PCR-näyte.

Virtsan PCR-analyysiä varten otetaan ensimmäinen annos, säiliön on oltava steriili.

Kuinka tehdä PCR-testi miehille ja naisille

PCR-analyysi otetaan miehiltä ja naisilta rokotushuoneessa, tämä on verta laskimosta, sylkeä, vanupuikkoja nielusta, risat, vanupuikko nenänielusta jne. Näytteenottomenetelmä ei ole erilainen.

Sukupuolitautien PCR otetaan synnytysklinikalla naisten gynekologisen tutkimuksen aikana, nämä ovat emättimestä, kohdunkaulasta, virtsaputkesta otettuja sivelynäytteitä. Miehillä andrologin tai venereologin luona käydessä tämä on virtsaputkesta otettu vanupuikko.

Näytteenottomateriaalin kaaviot PCR:ää varten

Kuinka kauan PCR kestää?

Potilaiden ei tarvitse odottaa kauan PCR-tutkimuksen tuloksia. Koko analyysiprosessi kestää yleensä useista tunteista (reaaliaikainen PCR) 2-10 päivään. Pääsääntöisesti potilas saa analyysitulokset käsiinsä 2-5 päivässä, enintään 10 päivässä, se riippuu analyysin tyypistä. Pisin aika on veren PCR-diagnostiikka HIV:n ja hepatiitin varalta ja vähiten sivelyt ja raapiminen - 2-3 päivää.

Negatiivinen tulos osoittaa, että tällä hetkellä biologisessa materiaalissa ei ole havaittu jälkiä tartunta-aineista. Toisin sanoen infektiota, jota varten tutkimus tehtiin, ei ole.

Positiivinen tulos osoittaa taudinaiheuttajajäämien havaitsemisen biologisista näytteistä. Tämä tarkoittaa, että ihmiskehossa on tällä hetkellä infektio.
On tapauksia, joissa PCR antaa positiivisen tuloksen, mutta aktiivista infektioprosessia ei havaita. Tätä ilmiötä kutsutaan "terveeksi kuljetukseksi". Tällaisen potilaan hoitoa ei vaadita, mutta heidän on oltava jatkuvassa dynaamisessa valvonnassa. Tällaiset tilanteet ovat tyypillisiä virusinfektioille: Epstein-Barr-virus (EBV), ginitaalherpes, sytomegalovirusinfektio (CMVI), ihmisen papilloomavirus (HPV), joissa näytteitä otetaan paikallisista pesäkkeistä tutkimusta varten (virtsaputken raapiminen, kohdunkaulan kanava, sylki). Samalla emme saa unohtaa, että terve kantaja voi välittää tartunnan muille ihmisille. Lisäksi tartuntaprosessin aktivointia ei ole suljettu pois. Tapauksissa, joissa PCR antaa positiivisen tuloksen veren tutkimuksessa, tätä ei voida enää pitää kantajana. Tällaiset potilaat tarvitsevat erityistä hoitoa havaitun patogeenin aiheuttamaan sairauteen.

Määrällisillä indikaattoreilla ei ole yleisiä asteikkoja. Lääkäri arvioi ne erikseen kunkin infektion osalta. Kvantitatiivinen tulos mahdollistaa infektion aktiivisuuden määrittämisen ja prosessin vaiheen tunnistamisen.

PCR-menetelmän luotettavuus

Tekniikan tehokkuuden arvioinnissa on kolme kriteeriä:

-Tarkkuus- infektion (tai sen puuttumisen) havaitseminen suurella todennäköisyydellä.

- Spesifisyys- tietyn patogeenin määrittämisen tarkkuus.

- Herkkyys- kyky tunnistaa patogeeni jopa pienellä määrällä geneettistä materiaalia biologisissa näytteissä.

PCR-menetelmää käytettäessä väärien positiivisten tulosten saaminen on melkein mahdotonta (eli jos taudinaiheuttaja ei ole läsnä, positiivista näytettä ei ole).

Väärä negatiivinen tulos on mahdollinen, mutta sitä tapahtuu harvoin. Samanlaisia ​​tilanteita syntyy, jos infektio ei ole tutkimuksen aikana aktiivinen. Esimerkiksi krooninen infektio ilman aktiivisuutta tai piilevä infektio.

PCR-analyysi: video