On erittäin tärkeää suorittaa täydellinen odottavan äidin tutkimus, jotta mahdollinen patologia voidaan hoitaa ajoissa ja estää vakavien komplikaatioiden kehittyminen. Yksi tällainen kysely on sukupuoliteitse tarttuvien infektioiden testi, joka suoritetaan menetelmällä PCR-diagnostiikka.
& nbsp & nbsp PCR-diagnostiikka (polymeraasiketjureaktio) on yksi nykyaikaisimmista ja luotettavimmista menetelmistä havaita infektioita ihmiskehossa. Tämän menetelmän avulla voit määrittää taudin aiheuttajan esiintymisen, vaikka se olisi läsnä näytteessä (testimateriaalissa) merkityksettömänä pitoisuutena - vain muutama sen DNA- tai RNA-molekyyli, mikä tekee tästä menetelmästä tarkimman .
& nbsp & nbsp Kun tartunnan aiheuttajan solut on kerrottu tällä tavalla, sen läsnäolo on myöhemmin helppo määrittää.
Milloin PCR-diagnostiikka suoritetaan?
& nbsp & nbsp Testit raskaudenaikaisten infektioiden varalta tehdään yleensä ilmoittautumisen yhteydessä synnytysneuvolaan. Valitettavasti kaikki synnytysneuvolat eivät tarjoa PCR-diagnostiikkaa maksutta. Itse asiassa kaikki laboratoriot eivät tee PCR-diagnostiikkaa. Tässä tapauksessa lääkäri lähettää lähetteen yksityiselle laboratoriolle tai klinikalle.
& nbsp & nbsp Infektioiden analyysi on joka tapauksessa erittäin tärkeää raskauden aikana. Koska useimmat sukupuoliteitse tarttuvat infektiot ovat oireettomia aiheuttamatta mitään epämukavuutta, ne voivat kuitenkin johtaa vakaviin raskauden komplikaatioihin, kuten ennenaikaiseen synnytykseen, kohdunsisäiseen kasvun hidastumiseen, sikiön epämuodostumisiin.
& nbsp & nbsp Sukupuolielinten infektioiden tarkastuksen on välttämättä suoritettava naiset, joiden edelliset raskaudet ovat keskeytyneet eri aikoina, sekä potilaat, joiden näytteessä oli merkkejä tulehdusprosessista (leukosyyttien määrän kasvu).
& nbsp & nbspOn suositeltavaa suorittaa PCR-diagnostiikka ennen 12. raskausviikkoa, koska jos on infektio, lääkäri määrää tukihoidon, joka vähentää komplikaatioiden riskiä, ja 16 viikon kuluttua hän suorittaa täyden hoidon. Noin 3 viikkoa hoidon päättymisen jälkeen kontrolli-PCR-testi on pakollinen sen tehokkuuden arvioimiseksi.
Miten PCR-diagnostiikka suoritetaan?
& nbsp & nbsp PCR-diagnostiikkaa varten gynekologi ottaa erikoisharjalla kohdunkaulan kanavasta, kun raskaana oleva nainen on gynekologisella tuolilla. Tämä toimenpide on täysin kivuton. Saatu materiaali asetetaan koeputkeen erityisellä väliaineella ja lähetetään laboratorioon.
& nbsp & nbsp Analyysi ei vaadi erityistä valmistelua. Tarkemman tuloksen saamiseksi on suositeltavaa olla huuhtelematta ja välttää seksiä kahden päivän ajan. Lisäksi näppäily otetaan aikaisintaan kolmen päivän kuluttua emättimen peräpuikkojen käytön päättymisestä.
& nbsp & nbsp PCR-diagnostiikan avulla havaitaan infektioita, kuten klamydia, mykoplasmoosi ja ureaplasmoosi, herpes, sytomegalovirusinfektio, papilloomavirusinfektio.
Klamydia
& nbsp & nbsp Raskauden alkuvaiheessa klamydiatartunta voi johtaa keskenmenoon, voi johtaa keskenmenoon, sikiön kohdunsisäisen kehityksen viivästymiseen. Raskauden myöhemmissä vaiheissa seuraavat ovat mahdollisia:
& nbsp & nbsp- istukan (istukkatulehdus) ja sikiön kalvojen vauriot (korioamnioniitti);
& nbsp & nbsp- klamydian tunkeutuminen lapseen kohdunsisäisen keuhkokuumeen (keuhkokuume) kehittyessä;
& nbsp & nbsp- vikojen muodostuminen sikiön kehityksessä.
& nbsp & nbspA vauva voi saada klamydiatartunnan synnytyksen aikana äidin synnytyskanavan kautta. Tässä tapauksessa vastasyntyneen silmät kärsivät useimmiten (kehittyy klamydiaalinen sidekalvotulehdus), mikä johtaa vakaviin komplikaatioihin, jopa täydelliseen sokeuteen.
& nbsp & nbspJos klamydia todettiin raskauden aikana, odottavaa äitiä ja lapsen isää on hoidettava antibiooteilla. Hoitojakson jälkeen on läpäistävä toistuva PCR-testi klamydian esiintymisen varalta.
Mykoplasmoosi ja ureaplasmoosi
& nbsp & nbsp Mycoplasma on bakteeriryhmä, johon kuuluu yli 40 lajia. Raskauden aikana tutkitaan kolmentyyppisten mykoplasmojen esiintyminen:
& nbsp & nbsp- mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, ureaplasma urealiticum.
& nbsp & nbsp Ureaplasmoosi ja mykoplasmoosi esiintyvät usein ilman oireita. Joillakin raskaana olevilla naisilla voi olla vuotoa sukuelinten kautta.
& nbsp & nbsp Mykoplasma-infektioon liittyy keskenmenon uhka raskauden alkuvaiheessa, sikiön kehityshäiriöt, polyhydramnion, istukan toimintahäiriöt, kalvotulehdus (koroamnioniitti), sikiövaurio (useimmiten kehittyy kohdunsisäinen keuhkokuume tai vaikuttaa lapsen hermostoon).
& nbsp & nbsp Mykoplasmoosin yhteydessä ennenaikaisen synnytyksen todennäköisyys kasvaa 2 - 3 kertaa. Synnytyksen aikana tartunnan saaneen äidin synnytyskanavan läpi kulkeminen voi johtaa mykoplasmavaurioon lapsen keuhkoputkissa tai keuhkoissa. Lisäksi mykoplasma-infektio on yleinen syy infektiokomplikaatioihin naisilla synnytyksen jälkeen (esimerkiksi synnytyksen jälkeinen endometriitti - kohdun limakalvon tulehdus).
& nbsp & nbsp Sukuelinten mykoplasman tunnistaminen PCR-diagnostiikan avulla on äärimmäisen tärkeää, koska tämä bakteeri on ehdoton patogeeni ihmisille. Sen esiintyminen näytteessä viittaa krooniseen tulehdusprosessiin ja vaatii kaikissa tapauksissa antibakteerista hoitoa. Antibiootteja määrätään naiselle 16 raskausviikon jälkeen sekä hänen seksikumppanilleen. Kolme viikkoa lääkkeiden ottamisen jälkeen on suoritettava PCR-kontrollikokeet sukuelinten mykoplasman varalta.
& nbsp & nbsp Mycoplasma hominis ja ureaplasma eivät ole absoluuttisia patogeenejä, eli niiden tunnistaminen ei aina osoita tulehdusprosessin olemassaoloa ja hoidon tarvetta. Nämä bakteerit löytyvät terveen naisen kehosta ja ovat osa emättimen normaalia mikroflooraa.
& nbsp & nbspJos mycoplasma hominis tai ureaplasma havaittiin raskauden aikana, määrätään yleensä lisäkokeita - kvantitatiivisia. Nämä ovat erikoiskasveja, jotka osoittavat, kuinka paljon bakteereja on naisen kehossa. Lähtöpisteen katsotaan olevan 10 4 CFU / ml. Jos mykoplasmojen tai ureaplasmojen määrä on pienempi kuin tämä arvo, hoitoa ei suoriteta. Muussa tapauksessa raskaana olevalle naiselle ja hänen kumppanilleen määrätään antibioottihoito ja pakollinen uusittava PCR-analyysi näiden bakteerien osalta kolmen viikon kuluttua hoidon päättymisestä.
& nbsp & nbsp Jos bakteeripitoisuus on alle 10 4 CFU/ml, ultraääni paljastaa kuitenkin merkkejä tulehdusprosessista istukassa, sikiön kalvoissa tai lapsivedessä, suoritetaan antibioottihoito.
Herpes
& nbsp & nbspHerpes on virus, joka saastuttaa limakalvoja ja ihoa. Tämä virus leviää ilmassa olevien pisaroiden, kosketuksen, kotitalouden ja sukupuoliteitse.
Herpes simplex -virusta (HSV) on kahta tyyppiä: ensimmäinen tyyppi vahingoittaa huulten limakalvoa, kasvojen ihoa (labiaalherpes) - HSV-1, toinen tyyppi vaikuttaa useammin sukuelinten (sukuelinten) limakalvoon herpes) - HSV-2. Joissakin tapauksissa sukuelinten herpes voi kuitenkin johtua tyypin 1 herpes simplex -viruksesta.
& nbsp & nbspHerpes-infektio on krooninen, eli tartunnan jälkeen virus ei poistu kokonaan elimistöstä ja se on läsnä siinä koko elämän ajan, uppoutuen ihmisen hermosolujen geneettiseen ketjuun.
& nbsp & nbsp Taudin merkkejä voivat olla: arkuus, ärsytys ja kutina sukuelinten alueella, kuplien ja pienten haavaumien esiintyminen limakalvoilla. Kuitenkin melko usein tauti etenee ilman oireita.
& nbsp & nbsp Raskauden aikana sekä naisen primaarinen herpes simplex -viruksen tartunta että olemassa olevan infektion aktivoituminen voi tapahtua normaalille raskaudelle ominaisen vastustuskyvyn heikkenemisen vuoksi.
& nbsp & nbsp Primaarisen herpesinfektion tapauksessa raskauden kululla on suuri komplikaatioriski, jonka vakavuus määräytyy ensisijaisesti raskauden keston perusteella. Mitä lyhyempi raskaus, sitä vakavammat ovat komplikaatiot.
& nbsp & nbsp Herpesviruksen aiheuttama infektio ensimmäisten 12 viikon aikana johtaa hyvin usein aborttiin, sikiön epämuodostumisiin, sikiön infektioon ja ihon, maksan ja hermoston vaurioitumiseen.
& nbsp & nbsp Raskauden myöhemmissä vaiheissa on olemassa ennenaikaisen synnytyksen, polyhydramnionin tai oligohydramnionin riski, ja myös sikiön tartunnan todennäköisyys säilyy.
& nbsp & nbsp Paljon pienempi vaara raskaana olevalle naiselle on kroonisen herpesmuodon paheneminen. Tässä tapauksessa sikiön patologioiden riski on minimaalinen. Kuitenkin, jos odottavan äidin sukuelinten herpes pahenee synnytyksen aikana, on mahdollista, että vauva saa tartunnan, kun se kulkee synnytyskanavan läpi.
& nbsp & nbsp Jos herpes simplex -viruksen PCR on positiivinen, suoritetaan hoito antiviraalisilla ja immunomoduloivilla lääkkeillä.
Sytomegalovirusinfektio
& nbsp & nbspSytomegalovirus (CMV) on herpesvirusperheeseen kuuluva virus, jonka kaikilla edustajilla on ominaisuus olla pysyvästi ihmiskehossa tartunnan jälkeen. Sytomegalovirus itsessään ei ole kovin tarttuva: sen leviäminen vaatii toistuvaa ja läheistä kosketusta virusinfektion kantajaan.
& nbsp & nbspTämä infektio tarttuu ilmassa olevien pisaroiden välityksellä, kotitaloudessa ja sukupuoliteitse. Ajoittain virus voi aktivoitua ja erittyä intensiivisesti virtsa- ja hengitysteiden kautta. Sytomegalovirusinfektio on useimmiten oireeton.
& nbsp & nbsp Ensisijainen sytomegaloviruksen aiheuttama infektio raskauden aikana voi johtaa sikiön epämuodostumisiin, kohdunsisäiseen kasvun hidastumiseen, kuurouteen, kehitysvammaisuuteen, istukan vajaatoimintaan ja aborttiin. Vauva voi saada tartunnan synnytyksen aikana (kulkiessaan synnytyskanavan kautta) ja rintamaidon kautta (imetettäessä).
& nbsp & nbsp Sytomegalovirusinfektion hoito raskauden aikana suoritetaan immunologisilla lääkkeillä.
Ihmisen papilloomavirusinfektio
& nbsp & nbsp Tällä hetkellä tunnetaan yli 100 erilaista ihmisen papilloomavirusta (HPV), jotka voidaan jakaa ehdollisesti kolmeen ryhmään:
& nbsp & nbsp- ei-onkogeeninen (ei pysty aiheuttamaan kasvainprosessia);
& nbsp & nbsp- alhainen onkogeeninen riski;
& nbsp & nbsp - korkea onkogeeninen riski (johtaa todennäköisimmin syöpään).
& nbsp & nbspPapilloomavirusinfektio tarttuu yleensä seksuaalisen kontaktin kautta, mutta tartunta on mahdollista lääketieteellisten toimenpiteiden aikana. Vastasyntynyt voi saada tartunnan kulkiessaan tartunnan saaneen äidin synnytyskanavan läpi.
& nbsp & nbspPapilloomavirusinfektion esiintyminen kehossa aiheuttaa joskus sukupuolielinten syylien (limakalvon kasvaimia) esiintymistä sukupuolielinten alueella, emättimessä, kohdunkaulalla sekä erilaisia kohdunkaulan leesioita onkologinen prosessi.
& nbsp & nbsp Useimmiten ihmisen papilloomavirusinfektion kantaminen on kuitenkin täysin oireetonta. HPV:n havaitseminen raskauden aikana, kliinisten oireiden puuttuessa, ei vaadi lääketieteellistä väliintuloa.
& nbsp & nbspJos kohdunkaulassa esiintyy samanaikaisia muutoksia (esimerkiksi sukupuolielinten syyliä), on tarpeen kiinnittää siihen enemmän huomiota ja suorittaa lisätutkimus - kolposkopia (kohdunkaulan tutkiminen mikroskoopilla) ja näytteenotto onkosytologia (normaalille limakalvolle epätyypillisten solujen tunnistaminen) kohdunkaulan hoidon tarpeeseen liittyvän kysymyksen ratkaisemiseksi.
& nbsp & nbsp Pieniä syyliä ei myöskään hoideta raskauden aikana, vain erittäin suuret tai aktiivisesti kasvavat syylät, jotka voivat häiritä lapsen normaalia syntymää, poistetaan.
& nbsp & nbsp Papilloomavirusinfektiota, johon liittyy vastasyntyneen hengitysteiden vaurioita (kurkunpään papillomatoosi) synnytyskanavan läpikulun aikana, esiintyy melko harvoin. Siksi emättimen tai ulkoisten sukupuolielinten pienten syylien esiintyminen raskaana olevalla naisella ei ole osoitus leikkauksesta.
GOU VPO "Krasnojarskin valtion lääketieteellinen akatemia
nimetty Yasenetskyn liittovaltion terveydenhuollon ja sosiaalisen kehityksen viraston mukaan "
Lääketieteellisen genetiikan ja kliinisen neurofysiologian laitos IPO
MENETELMÄN PERUSPERIAATTEET
POLYMERAASI KETJUREAKTIO
Metodologinen opas 3-4-vuotiaille opiskelijoille
yleislääketieteen erikoisaloilla (060101) ja
Krasnojarsk - 2007
Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Polymeraasiketjureaktiomenetelmän perusperiaatteet. Menetelmäkäsikirja yleislääketieteen (060101) ja pediatrian (060103) erikoisalojen 3-4-vuotiaiden opiskelijoiden opetuksen ulkopuoliseen työhön. - Krasnojarsk: Kustantaja GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42 s.
Metodologinen käsikirja täyttää täysin valtion standardin (2000) vaatimukset ja heijastaa nykyaikaisen perinnöllisten ihmisten sairauksien diagnosointimenetelmän päänäkökohtia - polymeraasiketjureaktiomenetelmää, opetusmateriaali on mukautettu koulutustekniikoihin ottaen huomioon erityispiirteet. koulutusta 3-4 lääketieteellisen ja lastenlääketieteellisen tiedekunnan kurssilla.
Arvostelijat: Lääketieteellisen genetiikan osaston johtaja, GOU VPO
Liittovaltion terveydenhuollon ja sosiaalisen kehityksen viraston Novosibirskin osavaltion lääketieteellinen yliopisto, lääketieteen tohtori, professori;
DNA kopiointi
Tämän menetelmän tutkimuskohteena on deoksiribonukleiinihappo (DNA). DNA on yleinen geneettisen tiedon kantaja kaikille maan päällä oleville organismeille (lukuun ottamatta RNA:ta sisältäviä mikro-organismeja). DNA on kaksoisjuoste, joka on kiertynyt kierteeksi. Jokainen juoste koostuu sarjaan kytketyistä nukleotideista. DNA-säikeillä on päinvastainen suunta: yhden juosteen 5 "pää vastaa toisen juosteen 3" päätä. DNA:n ainutlaatuinen ominaisuus on sen kyky monistua. Tätä prosessia kutsutaan replikointi... DNA-molekyylin replikaatio tapahtuu interfaasin synteettisen jakson aikana. Kumpikin "emo"-molekyylin kahdesta ketjusta toimii matriisina "tyttärelle". Replikaation jälkeen äskettäin syntetisoitu DNA-molekyyli sisältää yhden "äiti"-ketjun ja toisen "tytär", vasta syntetisoidun (puolikonservatiivinen menetelmä). Uuden DNA-molekyylin matriisisynteesiä varten on välttämätöntä, että vanha molekyyli poistetaan spiraalista ja venytetään. Replikaatio alkaa useista kohdista DNA-molekyylissä. DNA-molekyylin osaa yhden replikaation aloituspisteestä toisen alkupisteeseen kutsutaan replikoni.
Replikoinnin aloitus on aktivoitu alukkeet(siemenet), jotka koostuvat 100-200 emäsparista. DNA-helikaasientsyymi purkaa ja jakaa äidin DNA-kierteen kahdeksi juosteeksi, joihin komplementaarisuuden periaatteen mukaisesti DNA-polymeraasientsyymin osallistuessa kootaan "tytär"-DNA-säikeitä. Jotta entsyymi voisi aloittaa toimintansa, tarvitaan aloituslohko - pieni alkuperäinen kaksijuosteinen fragmentti. Aloituslohko muodostuu, kun aluke on vuorovaikutuksessa alkuperäisen DNA:n vastaavan juosteen komplementaarisen alueen kanssa. Jokaisessa replikonissa DNA-polymeraasi voi liikkua "emäjuostetta" pitkin vain yhteen suuntaan (5` => 3`).
Johtavassa säikeessä replikonin purkautuessa "tytär"-ketju rakentuu vähitellen jatkuvasti. Jäljellä olevalla langalla tytärketju syntetisoi myös suunnassa (5` => 3`), mutta erillisinä fragmentteina replikonin käämittyessä.
Siten "tytär"-säikeiden komplementaaristen nukleotidien lisäys tapahtuu vastakkaisiin suuntiin (antirinnakkais). Replikaatio kaikissa replikoneissa tapahtuu samanaikaisesti. "Tytär"-lankojen fragmentit ja osat, jotka on syntetisoitu eri replikoneina, ompelevat yhdeksi langaksi entsyymiligaasi. Replikaatiolle on ominaista puolikonservatiivisuus, anti-rinnakkaisisuus ja epäjatkuvuus. Solun koko genomi replikoituu kerran yhtä mitoottista sykliä vastaavan ajanjakson aikana. Replikaatioprosessin tuloksena yhdestä DNA-molekyylistä muodostuu kaksi DNA-molekyyliä, joista toinen juoste on peräisin emo-DNA-molekyylistä ja toinen, tytär, syntetisoituu vasta (kuvio 1).
Riisi. 1. DNA-molekyylin replikaatiokaavio.
Siten DNA-replikaatiosykli sisältää kolme päävaihetta:
1. DNA-kierteen irtoaminen ja juosteen erottaminen (denaturaatio);
2. pohjamaalien kiinnitys;
3. lapsilangan ketjun loppuun saattaminen.
PCR-menetelmän periaate
DNA:n replikaatio muodosti PCR:n perustan. PCR:ssä yllä mainitut prosessit suoritetaan koeputkessa syklisessä tilassa. Siirtyminen reaktiovaiheesta toiseen saavutetaan muuttamalla inkubointiseoksen lämpötilaa. Kun liuos kuumennetaan 93-95 °C:seen, DNA denaturoituu. Seuraavaan vaiheeseen siirtymiseksi - alukkeiden kiinnittämiseen tai "hehkutukseen" - inkubointiseos jäähdytetään 50-65 ° C:seen. Sitten seos kuumennetaan 70-72 °C:seen - taq-DNA-polymeraasin optimaalinen työ - tässä vaiheessa uusi DNA-juoste valmistuu. Sitten sykli toistetaan uudelleen. Toisin sanoen PCR-menetelmä on moninkertainen kopiomäärän lisääminen (vahvistusta) DNA-polymeraasientsyymin katalysoima DNA:n tietty alue.
Tytär-DNA-säikeiden pidentymisen tulee tapahtua samanaikaisesti molemmissa äidin DNA:n juosteissa, joten toisen juosteen replikaatioon tarvitaan myös aluke. Siten reaktioseokseen lisätään kaksi aluketta: yksi "+" -ketjua varten, toinen "-" -ketjua varten. Kiinnittyään DNA-molekyylin vastakkaisiin juosteisiin alukkeet rajoittavat sen osan, joka myöhemmin monistuu tai monistuu monta kertaa. Tällaisen fragmentin, jota kutsutaan amplikoniksi, pituus on yleensä useita satoja nukleotideja.
PCR-vaiheet
Jokainen vahvistussykli sisältää 3 vaihetta, jotka tapahtuvat eri lämpötilaolosuhteissa (kuvio 2).
· Vaihe 1: DNA:n denaturaatio . Se toimii 93-95 °:ssa 30-40 sekuntia.
· Vaihe 2: hehkutuspohjamaalit . Alukkeiden kiinnittäminen on komplementaarista vastaaville sekvensseille vastakkaisissa DNA-juosteissa tietyn kohdan rajoilla. Jokaisella pohjamaaliparilla on oma hehkutuslämpötilansa, jonka arvot ovat välillä 50-65 °C. Hehkutusaika 20-60 sek.
· Vaihe 3: DNA-juosteen pidennys Komplementaarinen DNA-juosteen pidennys tapahtuu ketjun 5 "päästä 3" päähän vastakkaisiin suuntiin, alkaen alukkeen kiinnityskohdista. Liuokseen lisätyt toimivat materiaalina uusien DNA-säikeiden synteesiin. Synteesiprosessia katalysoi taq-polymeraasientsyymi ja se tapahtuu 70-72 °C:n lämpötilassa. Synteesin kesto on 20-40 sekuntia.
Ensimmäisessä monistussyklissä muodostuneet uudet DNA-juosteet toimivat templaatteina toiselle monistussyklille, jossa muodostuu spesifinen DNA-amplikonin fragmentti (kuvio 3). Seuraavilla monistuskierroksilla amplikonit toimivat mallina uusien juosteiden synteesille.
Siten liuoksessa on amplikonien kertymistä kaavan 2" mukaisesti, jossa n on monistussyklien lukumäärä. Näin ollen, vaikka alkuperäisessä liuoksessa oli alun perin vain yksi kaksijuosteinen DNA-molekyyli, noin 108 amplikonimolekyyliä kertyy liuokseen 30-40 syklin aikana, määrä on riittävä tämän fragmentin luotettavaan visuaaliseen havaitsemiseen agaroosigeelielektroforeesilla.
Vahvistusprosessi suoritetaan erityisessä ohjelmoitavassa termostaatissa ( vahvistin), joka tietyn ohjelman mukaan muuttaa automaattisesti lämpötiloja vahvistusjaksojen lukumäärän mukaan.
Vahvistuksen suorittamiseen tarvitaan seuraavat komponentit:
· DNA-matriisi(DNA tai sen osa, joka sisältää halutun spesifisen fragmentin);
· Pohjusteet(synteettiset oligonukleotidit (20-30 nukleotidiparia), jotka ovat komplementaarisia DNA-sekvensseille määritetyn spesifisen fragmentin rajoilla). Spesifisen fragmentin valinnalla ja alukkeiden valinnalla on tärkeä rooli monistuksen spesifisyydessä, mikä vaikuttaa määrityksen laatuun.
· Deoksinukleotiditrifosfaatti (dNTP) seos(seos neljästä dNTP:stä, jotka ovat materiaalia uusien komplementaaristen DNA-säikeiden synteesiin vastaavina pitoisuuksina 200-500 μm)
· EntsyymiTaq-polymeraasi(lämpöstabiili DNA-polymeraasi, katalysoi alukeketjujen pidentymistä kiinnittämällä nukleotidiemäksiä peräkkäin syntetisoidun DNA:n kasvavaan ketjuun, 2-3 mM).
· Puskuriliuos(reaktioväliaine, joka sisältää Mg2+-ioneja, jotka ovat välttämättömiä entsyymin aktiivisuuden ylläpitämiseksi, PH 6,8-7,8).
RNA:ta sisältävien virusten genomin spesifisten alueiden määrittämiseksi RNA-templaatista saadaan ensin DNA-kopio käyttämällä käänteiskopioijaentsyymin (käänteiskopioijaentsyymin) katalysoimaa käänteistranskriptioreaktiota (RT).
Riisi. 2. Vahvistus (1. sykli).
Riisi. 3. Vahvistus (2. sykli).
PCR:n tärkeimmät käyttöalueet
Kliininen lääke:
o infektioiden diagnoosi,
o mutaatioiden havaitseminen, mukaan lukien perinnöllisten sairauksien diagnostiikka,
o genotyypitys, mukaan lukien HLA-genotyypitys,
o soluteknologiat
Ekologia (tapana seurata ympäristön esineiden ja elintarvikkeiden tilaa ja laatua)
Siirtogeenisten organismien (GMO) määritys
Henkilöllisyystodistus, isyys, oikeuslääketiede
Yleinen ja yksityinen biologia,
Perusperiaatteet
diagnostisten laboratorioiden järjestäminen
Työ PCR-laboratoriossa suoritetaan "Laitteen sääntöjen, turvatoimien, teollisuuden sanitaatiota, epidemiantorjuntajärjestelmää ja henkilökohtaista hygieniaa koskevien sääntöjen mukaisesti työskennellessään terveydenhuoltojärjestelmän terveys- ja epidemiologisten laitosten laboratorioissa (osastot, osastot) ."
DNA-näytteiden kontaminaatio
PCR-diagnostiikan suorittamiseen liittyy ongelma, joka johtuu menetelmän korkeasta herkkyydestä - mahdollisuudesta saastuminen. Pienten määrien positiivista DNA:ta (DNA-monistuksen spesifiset tuotteet - amplikonit; positiivisena kontrollina käytetty DNA-standardi; kliinisen näytteen positiivinen DNA) nieleminen reaktioputkeen johtaa tietyn DNA-fragmentin monistumiseen PCR:n aikana ja mm. seurauksena vääriin positiivisiin tuloksiin.
Työprosessissa saattaa olla kahdenlaisia saasteita:
1. ristiin saastuminen näytteestä näytteeseen (kliinisten näytteiden käsittelyn aikana tai reaktioseosta annosteltaessa), mikä johtaa satunnaisten väärien positiivisten tulosten ilmaantumiseen;
2. amplifikaatiotuotteiden saastuminen(amplikonit), mikä on tärkeintä, koska amplikoneja kertyy valtavia määriä PCR-prosessin aikana ja ne ovat ihanteellisia tuotteita uudelleenamplifikaatioon.
Lasien, automaattisten pipettien ja laboratoriolaitteiden, laboratoriopöytien pinnan tai jopa laboratoriohenkilöstön ihon pinnan jälkikontaminaatio johtaa systemaattisiin vääriin positiivisiin tuloksiin. Saastumislähteen määrittäminen voi olla erittäin vaikeaa, aikaa vievää ja kallista. Tähän mennessä saatu kokemus diagnostiikassa PCR-menetelmää käyttävien laboratorioiden työskentelystä mahdollistaa perusvaatimusten muotoilun tällaisten laboratorioiden organisaatiolle ja itse analyysien suorittamiselle. Näiden vaatimusten noudattaminen eliminoi saastumisen ja väärien positiivisten tulosten mahdollisuuden.
PCR-analyysin vaiheet
Ne on jaettu alueellisesti sijoittamalla ne erillisiin huoneisiin (kuva 4.5):
· PCR-huone, jossa suoritetaan kliinisten näytteiden käsittely, DNA-uutto, reaktioseoksen valmistelu PCR:ää varten ja PCR-asetus (jos olosuhteet ovat olemassa, myös kaksi viimeistä vaihetta suositellaan suoritettavaksi erillisessä lisähuoneessa). Näissä tiloissa on kiellettyä tehdä kaikenlaisia muita töitä tutkittavilla aineilla, joiden PCR-diagnostiikka suoritetaan tässä laboratoriossa.
· Post-PCR-huone, jossa amplifikaatiotuotteiden havaitseminen suoritetaan. Tässä huoneessa voidaan käyttää muita tunnistusmenetelmiä. On suositeltavaa sijoittaa tila amplifikaatiotuotteiden havaitsemista varten mahdollisimman kauas PCR-a edeltäneistä huoneista.
Työhuoneet on varustettu ultraviolettilampuilla, joiden maksimisäteily on 260 nm alueella (tyyppi DB-60) nopeudella 2,5 W per 1 m3. Valaisimet on sijoitettu siten, että työpöytien pinnat, laitteet ja materiaalit, joihin käyttäjä joutuu kosketuksiin PCR-analyysin aikana, altistuvat suoralle säteilylle. Säteilytys suoritetaan tunnin sisällä ennen työn aloittamista ja tunnin sisällä työn päättymisestä.
Lääkärit-laboratorioavustajat työskentelevät erityisissä laboratoriovaatteissa, jotka vaihdetaan siirryttäessä huoneesta toiseen, ja kertakäyttökäsineissä. Eri tilojen vaatteet käsitellään erikseen. Eri työntekijät työskentelevät PCR-analyysin eri vaiheissa.
Käytä työhön erillisiä annostelijasarjoja, muovi- ja lasiesineitä, laboratoriolaitteita, kylpytakeita ja käsineitä, jotka on suunniteltu eri analyysivaiheisiin ja joita ei siirretä huoneesta toiseen. Jokaisen huoneen varusteet, materiaalit ja inventaario on merkitty vastaavasti.
Kaikki työvaiheet suoritetaan vain käyttämällä kertakäyttöisiä tarvikkeita: automaattipipettien kärjet, koeputket, käsineet jne. Muista vaihtaa kärjet siirtyessäsi näytteestä näytteeseen. Käytä aerosolisulkusuodattimella varustettuja kärkiä estääksesi liuoksen mikropisaroiden pääsyn pipettiin. Käytetyt putket ja kärjet hävitetään erityisiin tai desinfiointiliuosta sisältäviin astioihin. Säilytä kliiniset näytteet erillään reagensseista.
Työpaikan käsittelyä ja siivoamista varten jokaisessa huoneessa on vanupuupuikkoja (lautasliina), pinsettejä, desinfiointi- ja inaktivointiliuoksia.
PCR-diagnostiikkalaboratoriossa ei saa tehdä töitä, jotka liittyvät tässä laboratoriossa diagnosoitujen patogeenien DNA-sekvenssejä tai geenifragmentteja sisältävien rekombinanttiplasmidien tuotantoon (kloonaukseen) ja eristämiseen.
Kliinisen materiaalin kokoelma
PCR:n testimateriaalina voi olla epiteelisolujen, veren, plasman, seerumin, keuhkopussin ja aivo-selkäydinnesteen, virtsan, ysköksen, liman ja muiden biologisten eritteiden kaapimia, biopsioita.
Materiaali otetaan vastaavan profiilin hoitohuoneessa. Keräyksen jälkeen näytteet tulee toimittaa PCR-diagnostiikkalaboratorioon mahdollisimman pian.
Näytteet tulee ottaa steriileillä, mieluiten kertakäyttöisillä instrumenteilla vain kertakäyttöisiin steriileihin muovisiin koeputkiin tai lasisiin koeputkiin, jotka on esikäsitelty tunnin ajan kromiseoksella, pestään perusteellisesti tislatulla vedellä ja kalsinoidaan uunissa 150 °C:ssa 1 tunnin ajan.
Havaintoalue (toinen kerros tai toinen rakennus).
Riisi. 4. PCR-laboratoriolaite elektroforeesitunnistuksella.
|
Havaintoalue (toinen kerros tai toinen rakennus)
Riisi. 5. PCR-laboratoriolaite fluoresenssitunnistimella (kvantitatiivinen analyysi).
Riisi. 6. DNA:n erotushuone. Kuvassa on pöytälaatikko, jossa on bakteereita tappava lamppu.
Riisi. 7. Vahvistushuone.
Riisi. kahdeksan. Havaintohuone.
Riisi. yhdeksän. Verinäytteet perinnöllisten sairauksien DNA-diagnostiikkaan.
Näytteiden varastointi ja kuljetus
Perinnöllisten sairauksien diagnosoimiseksi verinäytteitä säilytetään erikoispaperilomakkeilla tai muoviputkissa pitkään jäädytettynä (kuva 9).
Tartuntatautien diagnosointia varten näytteitä pidetään huoneenlämmössä enintään 2 tuntia. Jos tarvitaan pidempää säilytystä, näytteet voidaan laittaa jääkaappiin, jonka lämpötila on 2-8 ° C, enintään vuorokauden ajaksi. Pidempi varastointi (enintään 2 viikkoa) on sallittu jäädytettynä pakastimessa miinus 20 °C:n lämpötilassa. Näytteiden toistuva jäädyttäminen ja sulattaminen ei ole sallittua.
Jos PCR-diagnostiikkalaboratorio ja näytteenottotila on maantieteellisesti erotettu toisistaan, näytteiden kuljetus on suoritettava termosissa tai lämpösäiliöissä näytteiden säilytyssääntöjä ja tartuntamateriaalien kuljetussääntöjä noudattaen.
DNA:n eristäminen näytteistä
Kiinteäfaasisorptiomenetelmä on levinnyt laajalle, joka koostuu guanidiiniliuosta sisältävän hajottavan aineen lisäämisestä, DNA:n sorptiosta sorbentille sekä DNA:n toistuvasta pesusta ja resorptiosta puskuriliuoksella. Seerumin, plasman tai kokoveren tapauksessa käytetään yleensä fenoliuuttomenetelmää. Menetelmä sisältää proteiininpoiston fenolilla/kloroformilla ja sen jälkeen DNA:n (tai RNA:n) saostuksen etanolilla tai isopropanolilla. Käsittely suoritetaan 1,5 ml:n Eppendor P -mikrosentrifugiputkissa. Käsittelyaika on 1,5-2 tuntia (kuva 10).
Riisi. kymmenen. DNA:n eristäminen.
PCR:n suorittaminen
Tietty määrä näytettä käsitellystä kliinisestä näytteestä siirretään erityiseen Eppendorf-tyyppiseen mikrosentrifugiputkeen, jonka tilavuus on 0,2 tai 0,5 ml. Lisätään amplifikaatioseos, joka koostuu vedestä, PCR-puskurista, dNTP-liuoksesta, alukeliuoksesta ja liuoksesta. samaan putkeen Taq-polymeraasi (lisätään seokseen viimeisenä) Tyypillisesti reaktioseoksen tilavuus on 25 µl. Sitten jokaiseen putkeen lisätään yksi tippa mineraaliöljyä estämään reaktioseoksen haihtuminen monistuksen aikana. Putket siirretään ohjelmoitavaan termostaattiin (vahvistimeen), jossa vahvistus suoritetaan automaattisessa tilassa tietyn ohjelman mukaan (kuva 11).
Riisi. yksitoista. vahvistin" Lämpöpyöräilijä ».
Reaktioaika on valitusta ohjelmasta riippuen 2-3 tuntia. Rinnakkain koenäytteiden kanssa asetetaan kontrollinäytteitä: positiivinen kontrolli sisältää kaikki reaktion komponentit, mutta kliinisen näytteen materiaalin sijaan otetaan käyttöön tutkittavan geenin kontrolli-DNA-valmiste. Negatiivinen kontrolli sisältää kaikki reaktion komponentit, mutta kliinisen materiaalin tai DNA-valmisteen sijaan lisätään sopiva määrä deionisoitua vettä tai uutetta, joka ei sisällä tutkittavaa DNA:ta. Negatiivinen kontrolli on tarpeen reaktion komponenttien tarkistamiseksi, ettei niissä ole DNA:ta kontaminaatiosta johtuen, ja väärien positiivisten tulosten kirjaamisen poissulkemiseksi.
Tulosten rekisteröinti
Monistettu spesifinen DNA-fragmentti havaitaan agaroosigeelielektroforeesilla etidiumbromidin läsnä ollessa. Etidiumbromidi muodostaa DNA-fragmenttien kanssa stabiilin implantaatioyhdisteen, joka näkyy valonauhoina, kun geeliä säteilytetään UV-säteilyllä, jonka aallonpituus on 290-330 nm. Saatujen PCR-amplikonien koosta riippuen käytetään geeliä, jonka agaroosipitoisuus on 1,5 % - 2,5 %. Agaroosigeelin valmistamiseksi agaroosin, puskurin ja veden seos sulatetaan mikroaaltouunissa tai vesihauteessa ja lisätään etidiumbromidiliuos. 50-60 °C:seen jäähdytetty seos kaadetaan muottiin 4-6 mm paksuisella kerroksella ja geeliin tehdään erityisillä kammoilla taskuja näytteen levittämistä varten. Kammat asetetaan niin, että kuoppien pohjan ja geelin pohjan väliin jää 0,5-1 mm agaroosikerros. Geelin jähmettymisen jälkeen taskuihin laitetaan amplifikaattia 5-15 μl. On suositeltavaa suorittaa elektroforeesi DNA-fragmentin pituusmarkkerien seoksesta rinnakkain kontrolli- ja koenäytteiden kanssa. Tyypillisesti tällainen seos sisältää kymmenen DNA-fragmenttia, joissa on 100, 200, 300 jne. emäsparia.
Asettamalla tällaisen näytteen voit tarkistaa amplikonien pituuden kontrolli- ja koenäytteissä. Geeli levitetyn näytteen kanssa siirretään puskurilla täytettyyn elektroforeesikammioon, kammio liitetään virtalähteeseen ja vahvistustuotteiden elektroforeettinen erotus suoritetaan 30-45 minuutin ajan sähkökentän voimakkuudella 10-15 V / cm. Tässä tapauksessa reaktioseokseen sisältyvän väriaineen etuosan tulee kulkea vähintään 3 cm.
Elektroforeesin päätyttyä geeli siirretään transilluminaattorin lasille ja sitä tarkastellaan ultraviolettivalossa. Dokumentaatiota varten geeli valokuvataan Micrat 300 -filmille tai tallennetaan tietokoneeseen liitetyn videojärjestelmän avulla.
Kontrollinäytteet arvioidaan ensin. Positiivisen kontrollin elektroforeettisen kaistan tulee olla oranssi valonauha. Sen elektroforeettisen liikkuvuuden tulee vastata ohjeissa määriteltyä amplikonin pituutta.
Negatiivista kontrollia vastaavassa elektroforeettisessa kaistassa tällaisen vyöhykkeen tulisi puuttua. Tällaisen juovan läsnäolo negatiivisessa kontrollissa osoittaa kontaminaatiota - käytettyjen reagenssien kontaminaatiota analysoidulla DNA:lla tai amplikonilla. Testinäytteistä arvioidaan nauhan läsnäolo vastaavalla kaistalla, joka sijaitsee samalla tasolla kuin positiivisen kontrollinäytteen liuska. Vyöhykkeen luminesenssin intensiteetti vastaa näytteessä olevan analysoidun DNA:n määrää, mikä mahdollistaa PCR:n semikvantitatiivisen arvioinnin. Yleensä positiivisia tuloksia arvioidaan nelipisteasteikolla. Jos koenäytteen vyöhykkeen luminesenssi on erittäin heikko, tällainen näyte tulee järjestää uudelleen (kuva 12).
Riisi. 12. Agaroosigeelielektroforeesi.
PCR-sovelluksetpistemutaatioiden ja geenipolymorfismien diagnostiikka
Yksi PCR:n johtavista soveltamisalueista käytännön terveydenhuollossa on pistemutaatioiden ja geenipolymorfismien diagnosointi. . DNA-diagnostiikan suorat ja epäsuorat menetelmät erotetaan toisistaan. Tilanteissa, joissa tiedetään geeni, jonka vaurioituminen johtaa perinnöllisen sairauden kehittymiseen, tämä vaurio voidaan havaita molekyyligeneettisillä menetelmillä. Tällaisia menetelmiä kutsutaan suoriksi. Suorien menetelmien avulla havaitaan poikkeamat DNA:n primaarisessa nukleotidisekvenssissä (mutaatiot ja niiden tyypit). Suorille menetelmille on ominaista lähes 100 %:n tarkkuus.
Käytännössä näitä menetelmiä voidaan kuitenkin soveltaa tietyissä olosuhteissa.:
Perinnöllisen sairauden kehittymisestä vastaavan geenin tunnettu sytogeneettinen sijainti;
· Taudin geeni on kloonattava ja sen nukleotidisekvenssi tunnettava.
Suoran DNA-diagnostiikan tarkoituksena on tunnistaa mutanttialleelit.
Siten tilanteissa, joissa tiedetään tarkalleen, mikä DNA-vaurio johtaa perinnölliseen sairauteen, vaurion sisältävä DNA-fragmentti tutkitaan suoraan, eli käytetään suoraa DNA-diagnostiikan menetelmää.
Tähän mennessä monien sairauksien geenejä ei kuitenkaan ole kartoitettu, niiden eksoni-introni-organisaatiota ei tunneta, ja monille perinnöllisille sairauksille on ominaista selvä geneettinen heterogeenisyys, mikä ei salli suorien DNA-diagnostiikan menetelmien täysimääräistä käyttöä. Siksi tapauksissa, joissa vaurion lokalisointia ei tiedetä, käytetään erilaista lähestymistapaa, joka liittyy geenisairaudesta vastuussa olevan geenin läheisyyden tutkimukseen yhdistettynä perheanalyysiin, toisin sanoen epäsuoriin molekyyligeneettisen diagnoosin menetelmiin. perinnöllisiä sairauksia käytetään.
Pistemutaatioiden ja pienten deleetioiden havaitsemiseen voidaan käyttää erilaisia menetelmiä, mutta ne kaikki perustuvat PCR-menetelmän käyttöön. Tämän reaktion avulla voit moninkertaistaa DNA-nukleotidisekvenssin monta kertaa ja etsiä sitten mutaatioita. Menetelmät mutaatioita sisältävien DNA-fragmenttien etsimiseksi perustuvat mutanttien ja normaalien DNA-nukleotidisekvenssien vertailevaan analyysiin.
PCR-tuotteiden analyysi
suoran DNA-diagnostiikan prosessissa
Olettaa monistetun geenialueen erityispiirteiden tutkimuksen. Siten trinukleotiditoistojen laajenemisesta johtuvissa sairauksissa monistustuotteet eroavat pituudeltaan (heijastaen erilaista triplettien määrää tutkittavalla geenialueella) ja tästä johtuen niiden liikenopeudesta geelissä. Tämän ansiosta saadaan aikaan selkeä normaalien ja mutanttien alleelien elektroforeettinen erottelu ja patologisesti pidentyneen fragmentin tarkka määritys eli taudin DNA-diagnostiikka (kuva 13).
https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg "width =" 417 "height =" 110 src = ">
Riisi. neljätoista. Poistodiagnoosi GAG geenissä DYT 1 potilailla, joilla on dopa-riippumaton dystonia (polyakryyliamidigeelielektroforeesi). Kaistat 2,3,6 - sairas; kaistat 1,4,5 - ohjaus. Ohut nuoli osoittaa normaalia alleelia, lihavoitu nuoli osoittaa mutantin lyhyemmän alleelin (kolmen nukleotidin deleetio).
Jos tutkittu DNA-alue on kokonaan osa laajennettua deleetiota, ei tästä deletoidusta alleelista DNA:n PCR-amplifikaatiota tehdä, koska alukehybridisaatiolle ei ole paikkoja. Tässä tapauksessa homotsygoottinen deleetio diagnosoidaan PCR-reaktiotuotteen täydellisen puuttumisen perusteella (DNA-synteesi on mahdotonta molemmista geenikopioista). Heterotsygoottisella deleetiolla on mahdollista havaita normaalista (ehjästä) alleelista syntetisoitu PCR-tuote, mutta tällaisen mutaation luotettavaa diagnoosia varten on tarpeen käyttää kehittyneempiä DNA-kuvausmenetelmiä, jotka mahdollistavat annoksen arvioimisen. lopullinen PCR-tuote.
Pistemutaatioiden (useimmiten nukleotidisubstituutioiden) havaitsemiseksi tietyissä kohdissa PCR-menetelmää käytetään yhdessä muiden molekyyligeneettisten analyysimenetelmien kanssa. Jos lokalisointipaikka ja oletetun pistemutaation luonne tiedetään tarkasti, tällaisen mutaation kohdennettu havaitseminen restriktioendonukleaasit (restriktioentsyymit) - erityiset soluentsyymit, jotka erittyvät erilaisista bakteerikannoista.
Nämä entsyymit tunnistavat spesifisiä nukleotidisekvenssejä, joiden pituus on neljästä kymmeneen nukleotidia. Suorita sitten näiden sekvenssien restriktio (lat. (katkaisu)) osana kaksijuosteista DNA-molekyyliä. Jokainen restriktioentsyymi tunnistaa ja leikkaa kiinteässä paikassa tiukasti määritellyn, itselleen spesifisen nukleotidisekvenssin - rajoituspaikka (tunnistuspaikka).
Tapauksissa, joissa pistemutaatio muuttaa luonnollisen tunnistuskohdan tietylle restriktioentsyymille, tämä entsyymi ei pysty katkaisemaan mutantti-PCR-monistettua fragmenttia. Joissakin tapauksissa mutaatio johtaa uuden tunnistuskohdan ilmestymiseen tietylle restriktioentsyymille, joka puuttuu normista.
Molemmissa tilanteissa valitulla restriktioendonukleaasilla käsitellyt mutantti- ja normaalit PCR-tuotteet tuottavat eripituisia restriktiofragmentteja, jotka voidaan helposti havaita elektroforeesilla (kuvio 15).
Jos siis on tarpeen havaita nopeasti jokin tietty pistemutaatio, tehtävä rajoittuu vastaavan restriktioentsyymin etsimiseen, jonka tunnistuskohta sijaitsee häiriintyneen nukleotidisekvenssin kohdassa. PCR-tuotteiden prosessointi tällaisella restriktioentsyymillä tekee helpoksi erottaa normaalit ja mutanttialleelit. Restriktioanalyysi yksinkertaistaa huomattavasti tunnettujen pistemutaatioiden havaitsemista ja sitä käytetään nykyään laajalti perinnöllisten sairauksien suorassa DNA-diagnostiikassa.
Viimeinen vaihe mutaatioiden molekyyligeneettinen analyysi on tutkitun DNA-fragmentin nukleotidisekvenssin määrittäminen (sekvensointi), jota verrataan normiin ja muotoillaan lopullinen geneettinen diagnoosi. Molekyyligenetiikan menestyksen ansiosta DNA-diagnostiikan menetelmiä on nyt kehitetty yli 400 perinnölliseen sairauteen.
Riisi. 15. Pistemutaatioiden havaitseminen restriktioanalyysillä: A - monistettava geenialue, joka sisältää restriktiokohdanAGCTrestriktioendonukleaasiinAlu minä... MutaatioG→ Amuuttaa tätä nukleotidisekvenssiä, mikä johtaa restriktioentsyymiinAluItukossa; B - restriktiotuotteiden elektroforegrammi: kaista 1 - homotsygoottisuus normaalille alleelille; kaista 2, mutaatiohomotsygoottisuus; kaista 3 - heterotsygoottinen tila (normaali alleeli + mutaatio).
Perinnöllisten sairauksien diagnostiikka, joka perustuu suoraan mutanttialleelien tutkimukseen potilailla, heidän perheenjäsenillään tai epäillyillä heterotsygoottisilla patologisten mutaatioiden kantajilla, soveltuu pre-symptomaattiseen ja synnytystä edeltävään diagnostiikkaan, jota voidaan käyttää sikiön varhaisimmissa kehitysvaiheissa. ennen minkään kliinisen tai biokemiallisen sairauden oireiden ilmaantumista.
Huolimatta mutaatioiden havaitsemismenetelmästä, kunkin mutaation tarkat molekyyliominaisuudet voidaan saada vain suoralla sekvensoinnilla. Tämän prosessin automatisoimiseksi viime vuosina on käytetty laajalti erikoislaitteita - sekvenssereitä, jotka mahdollistavat DNA-tietojen lukemisen merkittävästi nopeuttamisen.
Tie molekyylibiologisen tutkimuksen laajemmalle soveltamiselle kliinisissä diagnostisissa laboratorioissa avaa analyyttisen prosessin kiihtymisen johtuen kaikkien toimenpiteiden suorittamisesta samassa jatkumossa ilman näytteen siirtoa, olosuhteiden luomisen kontaminaation estämiseksi rinnakkaistutkimuksen aikana. analyyttien lukumäärää ja tulosten objektiivista rekisteröintiä kussakin syklissä.
PCR-menetelmän perusmuunnoksia
Käytetään tunnettujen geenimutaatioiden nopeaan skannaukseen.
Multipleksinen (monialuke) PCR
Tämä menetelmä perustuu tutkittavan geenin useiden eksonien samanaikaiseen monistumiseen yhdessä reaktiossa. Tämä mahdollistaa kustannustehokkaan nopean yleisimpien mutaatioiden seulonnan. Esimerkiksi dystrofiinigeenin deleetioiden kuljettamisen nopeaksi diagnosoimiseksi potilailla, joilla on etenevä Duchenne/Becker-lihasdystrofia, sarja tämän geenin yleisimmin mutatoituneita eksoneja monistetaan samanaikaisesti. Koska nämä sairaudet periytyvät X-kytketyllä resessiivisellä tavalla ja ne liittyvät yhden X-kromosomin vaurioitumiseen pojilla, reaktiotuotteiden elektroforeesin aikana tapahtuvan pidennetyn deleetion tapauksessa yhden tai useamman DNA-fragmentin (eksonien) puuttuminen. ) paljastetaan, mikä voi toimia diagnoosin molekyylivahvistuksena. Lisäksi valitsemalla geenin tietyt alueet PCR-monistusta varten on mahdollista saada melko tarkka arvio deleetio- ja geenin hajoamispisteiden kokonaispituudesta (lihasta eksoniin).
Useiden multipleksireaktioiden yhdistetty käyttö mahdollistaa jopa 98 % kaikista deleetioista, joita esiintyy potilailla, joilla on etenevä Duchennen/Beckerin lihasdystrofia. Tämä on noin 60 % dystrofiinigeenin tunnettujen mutaatioiden kokonaismäärästä ja osoittaa tämän seulontamenetelmän erittäin korkeaa tehokkuutta dystrofinopatioiden DNA-diagnostiikassa (kuvio 16).
Riisi. 16. Duchennen lihasdystrofian suora DNA-diagnoosi moninkertaisella PCR:llä (agaroosigeelielektroforeesi). Jokaisessa tutkitussa yksilössä dystrofiinigeenin neljä eksonia monistettiin samanaikaisesti (eksonit 17, 19, 44 ja 45; nuolet osoittavat vastaavat monistustuotteet). Kaista 1 - kontrolli, kaistat 2-5 - potilaat, joilla on Duchennen lihasdystrofia, joissa on erilaisia dystrofiinigeenin deleetioita (kaistat 2 ja 5 - eksonin 45 deleetio, kaista 3 - eksonin 44 deleetio, kaista 4 - eksonien 17 ja 19 deleetio ).
Alleelispesifinen vahvistus
Menetelmä perustuu kahden riippumattoman alukeparin käyttöön geenin tietylle alueelle: yksi aluke molemmissa pareissa on yhteinen, ja toisella alukkeella kussakin parissa on erilainen rakenne ja se on komplementaarinen joko normaalille tai mutantille DNA:lle. järjestys. Tällaisen reaktion tuloksena kahden tyyppisiä PCR-tuotteita, normaaleja ja mutantteja, voidaan syntetisoida samanaikaisesti liuoksessa. Lisäksi käytettyjen alukkeiden suunnittelu mahdollistaa selkeän eron normaalien ja mutanttien monistustuotteiden välillä niiden molekyylikoon perusteella. Tämä menetelmä on hyvin havainnollistava ja antaa sinun varmistaa mutanttialleelin sekä homo- että heterotsygoottisen kantamisen.
Menetelmä monistetun DNA:n kohdistettuun modifiointiin
Menetelmä perustuu ns. mismatch-alukkeen käyttöön PCR:ssä (ei täysin komplementaarinen templaatille), joka eroaa templaatti-DNA-sekvenssistä yhdellä nukleotidilla. Tämän alukkeen sisällyttämisen seurauksena mutantti-PCR-tuotteen koostumukseen muodostuu siihen keinotekoisesti luotu restriktiokohta yhdelle restriktioendonukleaasille, mikä mahdollistaa tietyn tunnetun mutaation suoran DNA-diagnostiikan restriktioanalyysin avulla. Tällaisen keinotekoisen restriktiokohdan luominen on joskus tarpeen, jos haku ei paljastanut tunnetun ja saatavilla olevan entsyymin olemassaoloa, jonka "luonnolliseen" restriktiokohtaan vaikuttaa tutkitun mutaation ilmaantuminen DNA-molekyyliin. .
Käänteistranskriptaasi PCR (RT- PCR)
Tätä menetelmää käytetään tapauksissa, joissa on kätevämpää käyttää tutkimuskohteena ei genomista DNA:ta, vaan kompaktimpaa ja tiedollisesti "rikkaampaa" cDNA:ta, joka on saatu kudosnäytteiden, esimerkiksi biopsiamateriaalin tai lymfosyyttisolulinjojen, asianmukaisen käsittelyn jälkeen, fibroblastit jne. Tärkeä ehto tässä on halutun geenin ilmentyminen (ainakin minimaalinen) tutkittavassa kudoksessa.
Ensimmäisessä vaiheessa suoritetaan mRNA:n käänteistranskriptio, ja saadut cDNA-molekyylit toimivat templaattina PCR:lle. Tämän jälkeen cDNA:n kriittiselle alueelle, joka on monistettu riittävässä määrin, suoritetaan sekvensointi ja muut mutaatioseulontamenetelmät, suora elektroforeettinen tutkimus (deleetioiden, insertioiden jne. havaitseminen) tai insertio ekspressiojärjestelmään proteiinituotteen ja sen saamiseksi. suora analyysi.
Tämä menetelmä on erityisen tehokas "typistetyn" proteiinin synteesiin johtavien mutaatioiden havaitsemiseen (nonsense-mutaatiot, silmukointimutaatiot, suuret deleetiot) - niin kutsuttu PTT-analyysi (Protein Truncation Test). PTT-määritystä käytetään yleisesti laajennettujen monieksonigeenien, kuten Duchenne/Beckerin lihasdystrofiageenin, ataksia-telangiektasian tai tyypin 1 neurofibromatoosin, tutkimuksessa.
Reaaliaikainen PCR(Reaaliaikainen PCR)
Joka vuosi käytännön terveydenhuollossa reaaliaikaisesta PCR:stä on tulossa yhä suositumpi diagnostinen menetelmä. Sen pääominaisuus on pkertymisen seuranta ja kvantitatiivinen analyysi sekä saatujen tulosten automaattinen rekisteröinti ja tulkinta. Tämä menetelmä ei vaadi elektroforeesivaihetta, mikä mahdollistaa PCR-laboratorion vaatimusten vähentämisen. Tuotantotilan taloudellisuuden, henkilöstön määrän vähenemisen ja DNA/RNA:n kvantitatiivisen määrityksen kysynnän vuoksi tätä menetelmää on käytetty viime vuosina menestyksekkäästi kehittyneiden maiden suurimmissa terveys-epidemioissa, diagnostisissa ja tutkimuskeskuksissa. PCR:n nykyisessä ("klassisessa") muodossaan.
Reaaliaikainen PCR käyttää fluoresoivasti leimattuja oligonukleotidikoettimia DNA:n havaitsemiseen sen monistamisen aikana. Reaaliaikainen PCR mahdollistaa näytteen täydellisen analyysin 20-60 minuutissa ja pystyy teoriassa havaitsemaan jopa yhden DNA- tai RNA-molekyylin näytteestä.
Riisi. 17. Reaaliaikainen PCR.
Reaaliaikainen PCR käyttää TaqMan-järjestelmää, joka tarkkailee PCR:n kinetiikkaa suoraan monistuksen aikana favulla. Detektioon käytetään koetinta, jossa on fluorofori ja sammuttaja, jotka ovat komplementaarisia monistetun fragmentin keskiosalle. Kun fluorofori ja sammuttaja on sidottu oligonukleotidikoettimeen, havaitaan vain merkityksetöntä fluoresenssiemissiota. Monistusprosessin aikana Taq-polymeraasin 5'-eksonukleaasiaktiivisuuden vuoksi fluoresoiva leima siirtyy liuokseen, vapautuen sammuttimen läheisyydestä ja muodostaa fluoresoivan signaalin, joka vahvistuu reaaliajassa suhteessa solujen kertymiseen. amplifikaatti (kuva 17).
PCR-Real-Time tärkeimmät edut PCR:ään verrattuna geelielektroforeesilla:
· Koko menetelmä tapahtuu yhdessä koeputkessa;
· Menetelmä kestää 1 tunnin;
· Tarpeeksi 1-2 työhuonetta;
· Tuloksen kvalitatiivisen arvioinnin ohella on mahdollista arvioida kvantitatiivisesti (esim. AIDSin tai virushepatiitin viruslääkitystä määrättäessä on tiedettävä viruskuorma eli viruksen määrä yksikköä kohti, joka tarjoaa reaaliaikaisen PCR:n);
· Saastumisriski pienenee jyrkästi.
Johtopäätös
PCR-menetelmä on yksi yleisimmistä molekyylibiologisen tutkimuksen menetelmistä. Kliinikoiden tulee käyttää tätä menetelmää tarkoituksenmukaisesti, ja lääkärillä, joka päättää käyttää PCR:ää työssään, tulee olla jonkin verran tietoa tämän menetelmän ominaisuuksista ja ominaisuuksista. Toiseksi kliinikon ja PCR-laboratorion välillä on oltava tiivistä palautetta monimutkaisten tapausten analysoimiseksi ja oikean diagnoosistrategian kehittämiseksi. Kolmanneksi PCR-analyysi ei ole ihmelääke diagnoosissa (ensisijaisesti tartuntatautien) eikä korvaa olemassa olevia tutkimusmenetelmiä, vaan vain täydentää niitä. Ja mikä tärkeintä, PCR ei voi korvata intuitiota ja analyyttistä ajattelua, joka menestymiseen luottavalla lääkärillä pitäisi olla.
P . S ... Molekyylibiologinen tutkimus - muutos diagnostisissa ja hoitosuosituksissa. Laboratoriodiagnostiikan radikaalin painopisteen muutoksen mahdollisuus liittyy molekyylibiologisten menetelmien käyttöön. Emme voi puhua vain oikea-aikaisesta tiedosta, vaan sen saamisesta etukäteen. Jos nyt laboratoriotutkimuksia tehdään useimmiten jo kehittyneen taudin kanssa ja hoito on aloitettu, niin molekyylibiologisen laboratoriotiedon odotetaan mahdollistavan henkilön taipumuksen tietyntyyppisiin patologioihin ja herkkyyden tietyille lääkkeille paljastamisen, joka oikeuttaa ennakoivan, ennaltaehkäisevän ja yksilöllisen tulevaisuuden lääketieteen luonteen.
DIAGNOSTIIKKA- JA HOITOLINJIEN VAIHTO
PERINNÄLLISET SAIraudet
Tänään Tulevaisuudessa
Diagnoosi Geneettinen passi
8. Kuinka monta työhuonetta tarvitaan PCR-laboratorioon, jossa on fluoresenssin havaitseminen (kvantitatiivinen analyysi, Real-Time PCR)?
9. Mitä havaitseminen on?
10. Mitä DNA-diagnostiikan menetelmiä erotetaan?
11. Mikä entsyymi on PCR:n perusta?
12. Miksi havaintoalue tulisi poistaa muista työalueista?
13. Mikä on rajoitussivusto?
14. Mitä eroa on suoralla DNA-diagnostiikan menetelmällä ja epäsuoralla?
15. Mitä sekvensointi on?
16. Mikä on multipleksinen PCR?
17. Minkä tyyppiset mutaatiot määritetään PCR:llä?
18. Mitä on kontaminaatio?
19. Mikä on alleelispesifisen amplifikaatiomenetelmän ydin?
20. PCR-materiaalin säilytysolosuhteet?
21. Missä laitteessa vahvistus tapahtuu?
22. Mikä on käänteistranskriptaasi-PCR (RT-PCR) -menetelmä?
23. Mikä on PCR-diagnostiikan materiaali?
24. Luettelo kontaminaatiotyypit?
Itseopiskelutestit
1. Endonukleaasirestriktioentsyymit:
a) entsyymit, jotka "murtavat" DNA:ta tiukasti määrätyissä paikoissa;
b) entsyymit, jotka sillottavat DNA-molekyylin katkeamista;
c) entsyymit, jotka tuottavat yhdisteitä, jotka suorittavat DNA:n korjauksen.
2. Geenien monistus:
3. Mitä molekyyligenetiikan menetelmistä käytetään tunnetun sekvenssin mukaisen mutanttigeenin aiheuttamien sairauksien diagnosointiin?
a) tietyn restriktioentsyymin käyttö;
b) suora havaitseminen käyttämällä spesifisiä molekyylikoettimia;
c) normaalin restriktiofragmentin pituuden polymorfismin jakautumisen perheanalyysi.
4. DNA-sekvensointi:
a) DNA-emässekvenssin tunnistaminen;
b) DNA-palan moninkertainen toisto;
c) tutkittavan geenin sisältävän DNA-fragmentin eristäminen.
5. DNA-näytteiden saamiseksi voit käyttää :
b) korionivilli;
c) lapsivesi;
d) lapsivesisolut;
e) biopsiat ihosta, lihaksista, maksasta,
f) kaikki on oikein, paitsi kohta "c",
g) kaikki on oikein, paitsi kohta "d",
h) kaikki yllä oleva pitää paikkansa.
6. PCR-menetelmää käyttävien mutaatioiden diagnosoimiseksi:
a) genominen;
b) kromosomaalinen;
c) geeni (piste).
7. Pohja on:
a) komplementaarinen DNA-alue;
b) synteettinen oligonukleotidileimattu (radioaktiivinen tai fluoresoiva) sekvenssi, joka on komplementaarinen mutantti- tai normaaligeenille;
c) oligonukleotidi, joka toimii "siemenenä" ja käynnistää polynukleotidiketjun synteesin DNA- tai RNA-templaatissa.
8. Kuka kehitti PCR-menetelmän periaatteen?
b) K. Mullis
9. Käytetäänkö PCR-menetelmää trinukleotiditoistojen (dynaamisten mutaatioiden) laajenemisen diagnosoimiseen?
10. Millä alueilla PCR:ää käytetään?
a) kliininen lääketiede;
b) siirtogeenisten organismien (GMO) määrittäminen
c) henkilöllisyystodistus, isyys, oikeuslääketieteen tutkimus
d) kaikki edellä mainitut,
e) ei mikään yllä olevista..
Esimerkkivastaukset: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - c; 7 - c; 8 - b; 9 - a, 10 - d.
Pää
1. Barrels genetics. Moskova. GEOTAR, 2002.
Lisätiedot
1., Bakharev ja lasten synnynnäisten ja perinnöllisten sairauksien hoito. - Moskova, 2004.
2. DNA-diagnostiikka ja lääketieteellinen geneettinen neuvonta. - Moskova, 2004.
3. Gintergenetiikka. - Moskova, 2003.
4. Gorbunov Lääketieteellisen genetiikan perusteet. - SPb .: Intermedica, 1999.
5. Herrington S., J. McGee. Molekyylikliininen diagnostiikka. - Rauha, 1999.
6. Menshikov - kliinisen laboratoriodiagnostiikan biologinen tutkimus: ongelman mahdollisuudet (luennot). Kliininen laboratoriodiagnostiikka, nro 3, 2006.
7. Kornienko PCR-laboratorion työ biologisen materiaalin virtausanalyysissä. Kliininen laboratoriodiagnostiikka, nro 10, 2006.
8. PCR-laboratorion työn organisointi. Menetelmäohjeet. MU 1.3.1794-03. Venäjän federaation johtava terveyslääkäri, 2003.
9. Erlich H. A. PCR-tekniikka. - Percin-Elmer Cetus, 1993.
10. Heid C. A., Stevens J. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR. Genome Res. - Nro 6, 1996.
MENETELMÄN PERUSPERIAATTEET
POLYMERAASI KETJUREAKTIO
Menetelmäkäsikirja yleislääketieteen (060101) ja pediatrian (060103) erikoisalojen 3-4-vuotiaiden opiskelijoiden opetuksen ulkopuoliseen työhön.
GOU VPO "liittovaltion terveydenhuollon ja sosiaalisen kehityksen viraston Krasnojarskin valtion lääketieteellinen akatemia"
Venäjä, Krasnojarsk,
PCR on infektioiden diagnosointi, nykyaikainen ja erittäin tarkka menetelmä erilaisten tartuntatautien havaitsemiseen. Miten se eroaa muista analyyseistä?
Tämä lyhenne tarkoittaa "polymeraasiketjureaktiota". Wikipedian mukaan sen keksi vuonna 1983 amerikkalainen tiedemies Carey Mullis. Hän sai Nobel-palkinnon löydöstään.
Jonkin aikaa PCR:ää käytettiin vain tieteellisiin tarkoituksiin, minkä jälkeen lääketiede lainasi sen onnistuneesti. Tutkimuksen ydin on tunnistaa infektion aiheuttaja DNA:n ja RNA:n tasolla. Jokainen patogeeni, joka tunkeutuu DNA:han, muuttaa rakennettaan tietyn tyypin mukaan. Juuri muuttuneen DNA:n ulkonäön perusteella laborantille käy selväksi, mikä sairaus ihmiskehossa piilee. Muita PCR:n etuja ovat:
- Infektion perimmäisen syyn tunnistaminen, joka jätti "jälkiä" DNA:han. Useiden sairauksien yhdistelmästä on vaikea tunnistaa sitä, josta kaikki alkoi. Ja oikean diagnoosin ja tehokkaan hoidon valinnan kannalta ketjureaktiolla on valtava merkitys;
- PCR:ään ei asenneta vain muuttunutta DNA:ta, vaan myös spesifinen transformaatiokohta. Tämä poistaa epäilyt vääristä infektioista;
- PCR-diagnostiikka on niin herkkä, että se havaitsee yksittäiset bakteerit ja virukset. Ne voivat jäädä vereen epäasianmukaisen hoidon tai suunnittelemattomien lääkkeiden keskeytysten jälkeen. Pienin diagnosoitu määrä PCR-dekoodauksen aikana on 10 patogeenisolua. Muut testaustekniikat eivät ole yhtä tehokkaita;
- Patogeeniset mikro-organismit havaitaan jopa ilman vakavia sukupuolitaudin oireita. Varhaisessa vaiheessa havaittua sairautta ei hoideta niin kauan kuin sen edennyt muoto on;
- Potilas saa PCR-tulokset käsiinsä melko nopeasti. Infektioiden diagnosoimiseen kuluu enintään 4-6 tuntia. Yhdessä salauksen purkamisen kanssa koko prosessi kestää enintään 1-2 päivää;
- Kerran otettu DNA-materiaali riittää 5-6 testiin. Potilaan ei tarvitse ottaa näytteenottoja useita kertoja;
- PCR- ja infektiotutkimus ei pysähdy paikallaan, tämä alue kehittyy jatkuvasti. Keksitään uusia, herkempiä testijärjestelmiä ja tutkimuskustannukset pienenevät. Jos aiemmin se oli vain megalopolisien asukkaiden saatavilla, nyt alueiden sairaalahoitojen lääkärit eivät voi kuvitella sairauden määritelmää ilman sitä.
PCR-menetelmän ominaisuudet:
- Tarkkuus (virheet ovat minimaalisia ja niiden taajuus ei ylitä 0,01 %);
- Herkkyys (testi "laskee" yksittäiset bakteerit veressä ja sivelyt);
- Spesifisyys (PCR havaitsee infektiot, jotka eivät usein ilmene ollenkaan ennen vakavaa vaihetta);
- Ainutlaatuisuus (analyysit ovat tehokkaita tilanteissa, joissa muut tutkimukset eivät löydä mitään).
PCR-analyysin tulokset
Miten ketjureaktiomenetelmä toimii, miten analyysiin valmistaudutaan?
Laboratorio-olosuhteissa tapahtuva ketjureaktio käsittää DNA:n ja RNA:n eri osien moninkertaistamisen, jotta löydetään juuri katkennut linkki. Hapot monistetaan (kaksinkertaistetaan) entsyymivalmisteiden avulla. Laboratorioassistentti saa entsyymeillä riittävän määrän kopioita patogeenisestä DNA-alueesta verratakseen sitä tiettyjen infektion aiheuttamien sairauksien PCR-näytteisiin.
Pääsääntöisesti käytetään biologisia materiaaleja, jotka otetaan näytteenotolla tai sivelynä. PCR:n tunnistamiseksi (sukupuoliteitse tarttuvien infektioiden dekoodaamiseksi) otetaan sively emättimestä, kohdunkaulasta tai virtsaputkesta. Joskus käytetään myös virtsaa.
Hepatiitin, toksoplasmoosin tai HIV:n olemassaolon vahvistamiseksi tai kieltämiseksi verta otetaan laskimosta. Sormenpäästä otettu verinäyte antaa usein vääriä negatiivisia tuloksia. Mononukleoosi diagnosoidaan materiaalin tai kurkun keräämisen jälkeen. Tuberkuloosi voidaan havaita ysköksen keräämisen jälkeen, jota erittyy potilailla runsaasti aamuisin.
Emättimestä ja kohdunkaulasta ottaminen PCR:ää varten on yksinkertainen testi, jota sinun ei pitäisi pelätä. 2-3 päivää ennen kuin on tarpeen luopua seksuaalisesta aktiivisuudesta. Samanaikaisesti on kiellettyä käyttää alkalipohjaisia geelejä ja saippuoita henkilökohtaiseen hygieniaan. Voit pestä itsesi tavallisella lämpimällä vesijohtovedellä. Viimeinen pesu tehdään illalla ennen aamukäyntiä laboratoriossa tai lääkärin vastaanotolla.
Samman hoito emulsiovoideilla, voiteilla, peräpuikoilla tai suihkeilla, jos se suoritetaan, tulee myös lopettaa. Näytelmä otetaan muutaman ensimmäisen päivän aikana kuukautisten jälkeen tai välittömästi sen jälkeen. Tarkempien tulosten saamiseksi on suositeltavaa olla menemättä wc:hen 2-3 tuntiin ennen PCR-näytteen ottamista.
Miehillä virtsaputken näkemys otetaan ketjureaktion vuoksi. Biologinen materiaali kerätään steriilillä anturilla tai vanupuikolla, joka työnnetään virtsaputkeen. Toimenpiteen aikana saatat kokea lievää epämukavuutta tai polttavaa tunnetta. Miehet joutuvat myös väliaikaisesti luopumaan seksistä ja hygieniatuotteista. Viikkoa ennen analyysiä antibioottien ja muiden lääkkeiden hoito lopetetaan. Jos epämukavuus jatkuu keräyksen jälkeen, on suositeltavaa ottaa yhteyttä klinikalle mahdollisimman pian.
Oletetaan, että tutkimuksessa käytetään verta tai potilaan sukupuolielimistä otettua sivelyä. Geneettinen materiaali asetetaan PCR-vahvistimeen ja siihen lisätään entsyymejä. DNA kuumennetaan 90-95 °C:seen, kunnes ketju hajoaa useiksi lenkeiksi. Tätä prosessia kutsutaan denaturaatioksi. Reaktorin toiminnan aikana yhdestä DNA- ja RNA-näytteestä syntyy tuhansia kopioita sen analyysiin (reaktion dekoodaukseen) soveltuvien kopioiden tuloksista.
PCR-diagnostiikkatulokset
Ketjureaktio ei näytä ainoastaan infektion esiintymistä, vaan myös läsnä olevien patogeenien tarkan määrän. Viime vuosien kehitys on mutaatiogeenien keinotekoinen lisääminen ihmisen DNA:han, jotta voidaan tunnistaa alttius genotyypin muutokselle.
Mitä PCR-infektioiden diagnoosi paljastaa?
Testitulosten tulkinnan tekee yleensä hoitava lääkäri erikseen. Ketjureaktion mahdollisuudet antavat sinun vahvistaa tai kieltää seuraavien sairauksien esiintymisen:
Kuten tästä luettelosta käy ilmi, PCR-diagnostiikka antaa monien kapeasti keskittyneiden erikoisalojen lääkäreille rajattomat mahdollisuudet. Menetelmää voidaan käyttää pulmonologiassa, virologiassa, infektiosairauksissa, onkologiassa, gastroenterologiassa, hematologiassa, gynekologiassa ja urologiassa.
PCR-dekoodaus: tulokset
Vain lääkärit arvioivat ketjureaktioanalyysit kullekin potilaalle yksilöllisesti ottaen huomioon olemassa olevat patologiat ja krooniset sairaudet. PCR-analyysien tulokset osoittavat, kuten jo edellä mainittiin, patogeenisten bakteerien kvantitatiiviset ominaisuudet. Tarkistamalla heidän kanssaan lääkäri määrittää taudin vakavuuden ja vaiheen. Näiden indikaattoreiden perusteella tulevaisuudessa määrätään lääkkeiden annostus ja sisäänpääsyn kesto.
Negatiivinen PCR-tulos tarkoittaa, että kerätyssä biologisessa materiaalissa ei ole viruksia tai infektioita. Positiivinen PCR on hälytyssignaali. Tämä tarkoittaa, että potilaan verestä ja muista biologisista nesteistä on löydetty infektio.
Jos arvot ovat minimaaliset, tämä voi viitata taudin yksinkertaiseen kantamiseen, eikä vain taudin aktiiviseen kehittymiseen. Yksinkertaista infektiovektoria, joka havaitaan vain PCR:llä, mutta jolla ei ole muita oireita, on seurattava jatkuvasti lääkärin toimesta.
On tärkeää olla panikoimatta ja muistaa, että useimpia tieteen tuntemia viruksia voidaan hoitaa antibakteerisilla lääkkeillä. Vain pätevä asiantuntija, jolla on kokemusta tietyn sairauden hoidosta, voi valita ne ja korvata ne toisilla, jos ne eivät tehoa.
PCR:n dekoodaus voidaan suorittaa paitsi lääkärin pyynnöstä, myös heidän omasta tahdostaan. Usein sen tekevät lähitulevaisuudessa raskautta suunnittelevat naiset varmistaakseen, ettei sukupuolitauteja ole. Kun rekisteröidyt piirineuvontaan, raskaana olevan naisen on silti tehtävä tällainen diagnoosi.
Määrää PCR ehdottomasti naisille, joilla on ollut useita abortteja tai keskenmenoja eri syistä. Ennen IVF:ää tehdään analyysi kaikkien mahdollisen munasolun hylkäämisen syiden poistamiseksi.
Miehillä on tapana tehdä PCR loman jälkeen, jonka aikana oli lomaromantiikkaa tai jopa useita. Diagnostiikka auttaa heitä olemaan vaarantamatta henkeään ja mahdollisten seksikumppaneiden terveyttä.
Usein PCR:stä tulee potilaalle ainoa mahdollisuus päästä eroon taudista alkuvaiheessa, jolloin komplikaatioiden ja vakavan taudin riski on mitätön.
Nykyajan lääketieteessä biologisten ruumiinnesteiden PCR-analyysi on erittäin tarkkaa ja informatiivinen. Tämän analyysin avulla havaitaan virus- ja mikrobipartikkelien esiintyminen kehossa, vaikka sairaudet olisivat piileviä eivätkä aiheuta oireita.
Mitä PCR-analyysin nimittäminen tarkoittaa? Tämä lyhenne tarkoittaa polymeraasiketjureaktiomenetelmää - tämä on erityinen tapa suorittaa laboratoriotutkimusta. Tällä menetelmällä potilaalta saatu biologinen materiaali sijoitetaan erityiseen laitteeseen. Testialustaan lisätään joukko reagenssientsyymejä, jotka auttavat lisääntymään patogeenin (viruksen tai mikrobin) geneettisen materiaalin. Reaktion aikana syntyy suuri määrä DNA- tai RNA-kopioita, mikä mahdollistaa sekä virus- että mikrobiinfektioiden tunnistamisen tietokantaan verrattuna.
Mitä PCR-analyysin tulos tarkoittaa? Jos ihmiskehossa on infektioiden aiheuttaja, jopa piilotettu, tämä analyysi paljastaa paitsi sen läsnäolon, myös sen, kuinka paljon tätä infektiota on kehossa.
Infektioiden analysointia varten PCR-menetelmällä on mahdollista tutkia kaikki kehon biologiset nesteet - veri, virtsa, sylki, sukuelinten eritteet, lima kurkusta ja nenästä. Analyysiin tarvitaan hyvin vähän materiaalia, sillä jos taudinaiheuttajia on saatavilla, niiden kopioiden lisääntymisen vuoksi geneettisen tiedon pitoisuus saatetaan sellaiseksi, että se tunnistaa mikrobin tai viruksen ja määrittää sen tyypin. PCR-analyysin tarkkuus on erittäin korkea, tämän analyysin avulla voidaan nykyään määrittää lähes kaikki laajalle levinneet virus-, mikrobi- ja muut infektiot.
Mutta mitä PCR-analyysi useimmiten paljastaa? Tällä menetelmällä havaittavissa olevien infektioiden luetteloon kuuluvat tarttuvat, mukaan lukien sosiaalisesti vaaralliset infektiot, kuten tuberkuloosi tai hepatiitti B ja C. Samalla menetelmällä voidaan havaita HIV-infektio, klamydia- ja ureaplasma-infektiot, sekä hengityselinten että sukupuolielinten mykoplasmoosi. Tämän analyysin avulla havaitaan sammas, bakteerivaginoosi, trikomoniaasi. Tämän menetelmän ominaisuudet mahdollistavat piilotettujen infektioiden - erityyppisten herpes-, HPV- (papilloomavirus) - havaitsemisen sekä erityisen mahahaavojen kehittymisestä vastaavan mikrobin - Helicobatterin - tunnistamisen.
Nykyään voit tehdä PCR-analyysin melkein missä tahansa yksityisessä tai julkisessa laboratoriossa. Tämäntyyppisiä analyyseja tehdään kaikille, lapsille ja aikuisille. Analyysin tarkoituksesta riippuen analysoidaan erilaista biologista materiaalia sukupuolen mukaan.
Joten miehillä tehdään PCR-analyysi verestä tai virtsasta, virtsaputken erityksestä, nielun tai nenän limasta, eturauhasen mehusta tai jopa siemennesteestä. Naisten PCR-analyysi on mahdollista veressä ja virtsassa, emättimen eritteissä, virtsaputkessa, nenän ja nielun limassa.
Hyvin usein raskauden aikana käytetään PCR-analyysiä, jonka avulla emättimen eritteissä tai veressä paljastetaan piileviä infektioita, jotka vaativat erityistä seurantaa tänä aikana ja joskus riittävää hoitoa.
PCR kuinka analyysi tehdään
Lääkäri määrää infektioiden analyysin tällä menetelmällä, usein materiaalin kerääminen suoritetaan välittömästi lääkärin - urologin tai gynekologin - toimistossa. Kuinka PCR-määritys tehdään?
Tutkittava materiaali sekoitetaan laboratoriossa reagenssien kanssa ja reaktiota odotetaan. Patogeenien läsnä ollessa niiden DNA- tai RNA-kopiot lisääntyvät. Laite vertaa tunnistettuja geneettisen materiaalin fragmentteja tietokantoihin ja tunnistaa tarkasti infektion aiheuttajan. Tarvittaessa ilmoitetaan myös taudinaiheuttajan määrä tietyissä kehon nesteissä. Yleensä tutkimus kestää enintään 1-2 päivää, tarvittaessa suoritetaan pika-analyysejä.
Mistä PCR-analyysi on peräisin? Tämä riippuu siitä, minkä tyyppisiä taudinaiheuttajia odotetaan. Jos kyseessä on HIV tai hepatiitti - verta otetaan, jos kyseessä on sukuelinten tulehdus - virtsaputkesta tai emättimestä otetaan sively. Jos epäilet mononukleoosia tai herpestä, kurkusta otetaan vanupuikko. Myös virtsaa, selkäydinnestettä, haavavuotoa, ysköstä jne. voidaan käyttää.
PCR verikoe
Tarkkojen tulosten ja infektioiden diagnoosin saamiseksi on tärkeää luovuttaa verta aamulla tyhjään vatsaan. Verikoe PCR:llä pystyy tunnistamaan vaarallisten sairauksien aiheuttajat - HIV, hepatiitti, kuppa. Viruksen pahenemisen ja aktiivisuuden aikana verestä voidaan havaita herpesviruksia, papilloomeja ja joitain muita.
PCR-analyysi: valmistus
Jotta analyysi olisi ehdottoman tarkka, asianmukainen valmistelu on välttämätöntä. Helpoin tapa on valmistautua verikokeeseen, ruokavalioon tai toimintaan ei ole rajoituksia, veri tulee luovuttaa aamulla, tyhjään vatsaan. Virtsakoe otetaan sukuelinten pesun jälkeen, keskiosasta erityiseen steriiliin astiaan. Sukuelinten PCR-analyysi ansaitsee erityistä huomiota, joten on tärkeää osata valmistautua. Tutkimusta edeltävänä päivänä seksi on kielletty, ei suositella virtsaamista ennen tutkimusta. Naisten kuukautisten aikana analyysin päivämäärää lykätään 3-5 päivällä viimeisestä purkamisesta.
Kuinka kauan PCR-analyysi kestää?
Analyysi voi laboratorion valmiuksista riippuen kestää useista tunteista useisiin päiviin. Kuinka monena päivänä keskimäärin PCR-analyysi tehdään? Yleensä se on yksi tai kaksi päivää. Hätätilanteessa analyysi voidaan tehdä samana päivänä muutaman tunnin kuluttua.
Nykyaikanamme molekyyligenetiikkaa käytetään laajasti lääketieteen eri aloilla. Sen perustamisesta lähtien siitä on tullut yksi tehokkaimmista diagnoosimenetelmistä ja se on mahdollistanut ihmiskehon infektioiden tunnistamisen nopeasti ja tarkasti. Jos sinun on suoritettava DNA-diagnostiikka Moskovassa, kutsumme sinut käyttämään Euromedprestige-klinikan palveluita. Keskustemme asiantuntijoilla on laaja kokemus geneettisen analyysin alalla ja ne takaavat DNA-materiaalin korkean tarkkuuden mahdollisimman lyhyessä ajassa!
Miksi DNA-diagnostiikkaa tehdään Moskovassa?
DNA-diagnostiikalla tarkoitetaan laajaa valikoimaa mikrobiologiassa infektiosairauksien havaitsemiseen käytettyjä tutkimuksia. Viime vuosina virukset ja bakteerit ovat kehittyneet ja kehittyneet nopeasti, niitä on enemmän ja niiden toteaminen on yhä vaikeampaa. Geneettisten menetelmien käyttö mahdollistaa yksittäistenkin mikro-organismien löytämisen testinäytteestä ja useiden taudinaiheuttajien tunnistamisen kerralla yhdestä biologisesta näytteestä.
Moskovan DNA-diagnostiikan yleisin tekniikka klinikallamme on PCR (polymeraasiketjureaktio). Sen toteutuksen aikana tapahtuu useita DNA-nukleiinihapon yksittäisten osien selektiivistä kopiointia, joka suoritetaan entsyymien (monimutkaisten proteiinimolekyylien) avulla. Reaktio suoritetaan erityisessä laitteessa - vahvistimessa, joka ajoittain lämmittää ja jäähdyttää näyteputkia ja näyttää sitten tiedot reaaliajassa näytöllä kaavioiden muodossa.
Tutkimusmahdollisuudet ovat suuret. Sen avulla on mahdollista määrittää suuri määrä sairauksia, mukaan lukien melkein kaikki sukupuoliteitse tarttuvat infektiot:
- ureaplasma;
- klamydia;
- Candida sienet;
- gardnerella;
- Trichomonas;
- gonokokit ja muut.
Usein on tilanteita, joissa lääkärin on määritettävä hoidon tehokkuus tai taudin paranemisaste - ja tässä tapauksessa DNA-diagnostiikasta Moskovassa tulee yksinkertaisesti korvaamaton. Se on erityisen tärkeää piilevien infektioiden yhteydessä, joita on vaikea havaita mikroskopialla.
PCR-menetelmä on yksinkertainen suorittaa ja sillä on monia etuja:
- Korkea spesifisyys - tutkimuksen aikana näytteestä eristetään DNA-fragmentti, joka on luontainen vain tietylle patogeenille.
- Yliherkkyys - infektio voidaan havaita, vaikka testimateriaalissa olisi vain yksi virus tai bakteerisolu.
- Monipuolisuus - mitä tahansa biologista materiaalia voidaan käyttää diagnoosin tekemiseen, koska infektio löytyy usein kaikista kudoksista.
- Suora havaitseminen - toisin kuin monet muut tekniikat, PCR auttaa tunnistamaan taudinaiheuttajaa ei epäsuorien merkkien avulla, vaan sen suoralla läsnäololla kerätyssä materiaalissa.
- Mahdollisuus prekliiniseen DNA-testaukseen Moskovassa - patogeenit voidaan havaita jo ennen oireiden alkamista, mukaan lukien itämisajan aikana.
0Matriisi (=> Analyysit) Taulukko (=> 2) Taulukko (=>. Html) 2
Kuinka valmistautua kokeeseen
Patogeenin tunnistamiseksi on sallittua käyttää erilaisia materiaaleja - verta, ysköstä, virtsaa, epiteelin raapimista emättimestä, kohdunkaulasta tai virtsaputkesta. Suoritetun analyysin tarkkuus riippuu suurelta osin näytteenoton steriiliydestä. Koska PCR on herkempi, mahdollinen kontaminaatio näytteessä voi vääristää tulosta.
Tärkeä rooli diagnoosin luotettavuudessa on potilaan alustavalla valmistelulla tutkimukseen. Se ei aiheuta vaikeuksia, ja siinä säädetään seuraavien suositusten täytäntöönpanosta:
- Antibioottien käyttö on lopetettava 1 kuukausi ennen testiä.
- Moskovan keskuksemme DNA-diagnostiikan veri luovutetaan aamulla tyhjään mahaan.
- Virtsatessa ensimmäinen aamuannos kerätään steriiliin astiaan sukuelinten perusteellisen hygienian jälkeen.
- Sukupuolielinten tulehduksia tutkittaessa - sulje pois intiimi elämä 72 tuntia ja virtsaaminen 3-4 tuntia ennen materiaalin ottamista. Sukuelinten hygieniaa ei pidä suorittaa eilisestä edelliseen päivään.
DNA-diagnostiikan tarkkuus Moskovassa keskuksessamme
Kaikki testit keskuksemme seinien sisällä ovat yksinomaan sertifioitujen asiantuntijoiden suorittamia. Laboratorio on varustettu viimeisimmällä DNA-testauksen edistyksellä inhimillisten virheiden todennäköisyyden minimoimiseksi. Korkean teknologian laitteet, joita Euromedprestige-asiantuntijat käyttävät DNA-diagnostiikassa Moskovassa, mahdollistavat tulosten saamisen 97% tarkkuudella.
Edistyneen tieteellisen ja teknisen kehityksen ansiosta menetelmällä ei ole analogeja laadun ja hintasuhteen suhteen. Potilas saa edullisesti mahdollisuuden saada nopeasti selville diagnoosinsa ja aloittaa tunnistetun sairauden hoidon jo ennen kuin se alkaa aiheuttaa komplikaatioita.
gastroenterologia diagnostinen kompleksi - 5 360 ruplaa
VAIN MAALISKUU säästö - 15%