Очень важно выполнить полноценное обследование будущей мамы для того, чтобы вовремя провести лечение возможной патологии и предупредить развитие серьёзных осложнений. Одним из таких обследований является анализ на инфекции, передающиеся половым путём , который проводится при помощи метода ПЦР диагностики .
ПЦР диагностика (полимеразная цепная реакция) - это один из современных и наиболее достоверных методов выявления инфекций в организме человека. Этот метод позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе (исследуемом материале) тот присутствует в незначительной концентрации - всего несколько молекул его ДНК или РНК, что делает этот метод наиболее точным.
Проводится анализ следующим образом: в пробирке многократно копируют определённый участок ДНК бактерии или вируса, добавляя специальные реактивы. Размножив таким способом клетки возбудителя инфекции, впоследствии легко определить её наличие.
Когда проводят ПЦР диагностику?
Анализы на инфекции во время беременности обычно берутся при постановке на учёт в женской консультации. К сожалению, не во всех женских консультациях ПЦР диагностика проводится бесплатно. Собственно и не во всех лабораториях проводят ПЦР диагностику. В таком случае врач выдаёт направление в частную лабораторию или клинику.
Анализ на инфекции в любом случае является очень важным во время беременности. Так как большинство инфекций, которые передаются половым путём, протекает бессимптомно, не вызывая никакого дискомфорта, однако может приводить к серьёзным осложнениям беременности, например, к преждевременным родам , задержке внутриутробного развития плода , порокам развития плода.
Обследование на половые инфекции обязательно должны пройти женщины, у которых предыдущие беременности прерывались на разных сроках, а также пациентки, в мазках которых обнаружены признаки воспалительного процесса (увеличение количества лейкоцитов).
Проводить ПЦР диагностику желательно до 12-й недели беременности, так как при наличии заражения врач назначит поддерживающее лечение, которое снижает риск осложнений, а после 16 недель - проведёт полноценное лечение. Примерно через 3 недели после окончания лечения обязательно делается контрольный анализ ПЦР для оценки его эффективности.
Как проводится ПЦР диагностика?
Мазок на ПЦР диагностику врач-гинеколог берёт специальной щёточкой из канала шейки матки, когда беременная женщина находится на гинекологическом кресле. Эта процедура абсолютно безболезненная. Полученный материал помещается в пробирку со специальной средой и отправляется в лабораторию.
Какой-либо особой подготовки к проведению анализа не требуется. Желательно для более точного результата в течение двух дней не спринцеваться и избегать сексуальных контактов. Кроме того, мазок берётся не раньше чем через три дня с момента окончания использования влагалищных свечек.
При помощи ПЦР диагностики выявляются такие инфекции как: хламидиоз, микоплазмоз и уреаплазмоз, герпес, цитомегаловирусная инфекция, папилломавирусная инфекция.
Хламидиоз
На ранних сроках беременности заражение хламидиозом может привести к выкидышу, может привести к неразвивающейся беременности, к задержке внутриутробного развития плода. На более поздних сроках беременности возможны:
- поражение плаценты (плацентит) и оболочек плода (хориоамнионит);
- проникновение хламидий к ребёнку с развитием внутриутробной пневмонии (воспаления лёгких);
- формирование пороков в развитии плода.
Ребёнок может заразиться хламидиозом во время родов, проходя через родовые пути матери. При этом чаще всего поражаются глаза новорожденного (происходит развитие хламидийного конъюнктивита), что приводит к серьёзным осложнениям, вплоть до полной слепоты.
Если хламидиоз был выявлен во время беременности, то обязательно проводится лечение антибиотиками будущей мамы и отца ребёнка. После курса терапии необходимо сдать повторный анализ ПЦР на наличие хламидий.
Микоплазмоз и уреаплазмоз
Микоплазмы - это группа бактерий, которая включает в себя более 40 видов. Во время беременности обследование проводится на присутствие трёх видов микоплазм:
- микоплазма гениталиум, микоплазма хоминис, уреаплазма уреалитикум.
Уреаплазмоз и микоплазмоз часто протекают без каких-либо симптомов. У некоторых беременных женщин могут быть выделения из половых путей.
Микоплазменная инфекция несёт угрозу выкидыша на ранних сроках беременности, нарушения развития плода, многоводия, дисфункции плаценты, инфицирования плодных оболочек (хориоамнионит), поражения плода (наиболее часто развивается внутриутробная пневмония или поражается нервная система ребёнка).
При микоплазмозе в 2 - 3 раза возрастает вероятность преждевременных родов. Во время родов прохождение через родовые пути заражённой матери может привести к поражению микоплазмами бронхов или лёгких младенца. Кроме того, микоплазменная инфекция является частой причиной инфекционных осложнений у женщины после родов (например, послеродовый эндометрит - воспаление слизистой оболочки матки).
Важнейшее значение имеет выявление при помощи ПЦР диагностики микоплазмы гениталиум, так как эта бактерия является для человека абсолютным патогеном. Её присутствие в пробе свидетельствует о хроническом воспалительном процессе и во всех случаях требует антибактериального лечения. Антибиотики назначаются женщине после 16-ти недель беременности, а также её половому партнёру. Через три недели после окончания приёма препаратов обязательно сдаются контрольные анализы ПЦР на микоплазму гениталиум.
Микоплазма хоминис и уреаплазма не являются абсолютными патогенами, то есть не всегда их выявление говорит о наличии воспалительного процесса и необходимости лечения. Эти бактерии могут встречаться в организме здоровой женщины и входят в состав нормальной микрофлоры влагалища.
Если во время беременности была выявлена микоплазма хоминис или уреаплазма, то обычно назначаются дополнительные анализы - количественные. Это специальные посевы, которые показывают, в каком количестве бактерии присутствуют в организме женщины. Точкой отсчёта принято считать 10 4 КОЕ/мл. Если количество микоплазм или уреаплазм меньше этого значения, то лечение не проводят. В противном случае беременной женщине и её партнёру назначают антибактериальную терапию, с обязательным повторным анализом ПЦР на эти бактерии через три недели после проведённого курса лечения.
Кроме того, при решении вопроса о необходимости терапии микоплазмоза и уреаплазмоза учитываются данные ультразвукового исследования. Если концентрация бактерий меньше, чем 10 4 КОЕ/мл, однако при УЗИ выявляются признаки воспалительного процесса в плаценте, плодных оболочках или околоплодных водах, проводится лечение антибиотиками.
Герпес
Герпес - это вирус, который поражает слизистые оболочки и кожу. Этот вирус распространяется воздушно-капельным, контактным, бытовым, а также половым путём.
Вирус простого герпеса (ВПГ) бывает двух типов: первый тип вызывает поражение слизистой губ, кожи лица (лабиальный герпес) - ВПГ-1, второй тип чаще поражает слизистую половых органов (генитальный герпес) - ВПГ-2. Однако в некоторых случаях генитальный герпес может быть вызван вирусом герпеса 1-го типа.
Инфекция герпеса является хронической, то есть после заражения вирус не выводится из организма полностью и присутствует в нём пожизненно, встраиваясь в генетическую цепочку нервных клеток человека.
Среди признаков заболевания могут быть: болезненность, раздражение и зуд в области половых органов, появление пузырьков и маленьких язвочек на слизистых оболочках. Однако довольно часто болезнь протекает без каких-либо симптомов.
Во время протекания беременности может произойти как первичное заражение женщины вирусом простого герпеса, так и активация уже имеющейся инфекции - из-за снижения иммунитета, характерного для нормально протекающей беременности.
При первичном заражении герпесом течение беременности подвергается большому риску осложнений, тяжесть которых определяется в первую очередь сроком беременности. Чем меньше срок беременности, тем серьёзнее осложнения.
Заражение вирусом герпеса в первые 12 недель очень часто приводит к прерыванию беременности, возникновению у плода пороков развития, инфицированию плода с поражением кожи, печени и нервной системы.
На более поздних сроках беременности есть риск преждевременных родов, многоводия или маловодия, и также сохраняется вероятность инфицирования плода.
Гораздо меньшую опасность представляет для беременной женщины обострение хронической формы герпеса. В данном случае риск патологий развития плода будет минимальным. Однако если у будущей мамы генитальный герпес обостряется на момент родов, то существует вероятность заражения ребёнка при его прохождении через родовые пути.
В случае положительной ПЦР на вирус простого герпеса проводится лечение противовирусными и иммуномодулирующими препаратами.
Цитомегаловирусная инфекция
Цитомегаловирус (ЦМВ) - это вирус семейства герпесвирусов, все представители которого имеют свойство постоянного нахождения в организме человека после заражения. Сам по себе цитомегаловирус не очень заразен: для его передачи требуются частые и тесные контакты с носителем вирусной инфекции.
Передаётся данная инфекция воздушно-капельным, бытовым и половым путём. Время от времени вирус может активироваться, интенсивно выделяясь через мочеполовые и дыхательные пути. Заражение цитомегаловирусом чаще всего протекает бессимптомно.
Первичное заражение цитомегаловирусом во время беременности может привести к возникновению пороков развития у плода, задержке внутриутробного развития, глухоте, умственной отсталости, к недостаточности функции плаценты, прерыванию беременности. Ребёнок может заразиться во время родов (при прохождении через родовые пути) и через материнское молоко (при кормлении грудью).
Лечение цитомегаловирусной инфекции во время беременности проводят иммунологическими препаратами.
Папилломавирусная инфекция
В настоящее время известно более 100 различных типов вируса папилломы человека (ВПЧ), которые условно можно разделить на три группы:
- неонкогенные (не способные вызвать опухолевый процесс);
- низкого онкогенного риска;
- высокого онкогенного риска (с большой вероятностью могут привести к раку).
Передаётся папилломавирусная инфекция, как правило, половым путём, однако возможно заражение во время медицинских манипуляций. Новорожденный может заразиться при прохождении через родовые пути заражённой мамы.
Наличие папилломавирусной инфекции в организме иногда становится причиной появления кондилом (выросты на слизистой оболочке) в области половых органов, во влагалище, на шейке матки, а также различных поражений шейки матки, вплоть до онкологического процесса.
Однако чаще всего носительство папилломавирусной инфекции протекает абсолютно бессимптомно. Выявление ВПЧ во время беременности, при отсутствии клинических проявлений, не требует медицинского вмешательства.
При наличии сопутствующих изменений на шейке матки (например, кондилом) необходимо более пристальное внимание к ней и проведение дообследования - кольпоскопии (осмотр шейки матки при помощи микроскопа) и взятия мазка на онкоцитологию (выявление нетипичных для нормальной слизистой оболочки клеток) для решения вопроса о необходимости лечения шейки матки.
Мелкие кондиломы также не лечатся во время беременности, удаляются только очень крупные или активно растущие кондиломы, которые могут помешать нормальному рождению ребёнка.
Заражение папилломавирусной инфекцией с поражением дыхательных путей новорожденного (папилломатозом гортани) во время прохождения через родовые пути происходит достаточно редко. Поэтому наличие мелких кондилом влагалища или наружных половых органов у беременной женщины не является показанием к операции
ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия
имени -Ясенецкого Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию »
Кафедра медицинской генетики и клинической нейрофизиологии ИПО
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Методическое пособие для студентов 3-4 курсов
по специальностям лечебное дело (060101) и
Красноярск - 2007
Шнайдер, Н. А., Бутьянов, Р. А. Основные принципы метода полимеразной цепной реакции. Методическое пособие для внеаудиторной работы студентов 3-4 курсов по специальностям лечебное дело (060101) и педиатрия (060103). – Красноярск: Изд-во ГОУ ВПО КрасГМА, 2007. – 42с.
Методическое пособие полностью соответствует требованиям Государственного стандарта (2000) и отражает основные аспекты современного метода диагностики наследственных заболеваний человека – метода полимеразной цепной реакции, учебный материал адаптирован к образовательным технологиям с учетом специфики обучения на 3-4 курсах лечебного и педиатрического факультетов.
Рецензенты: заведующая кафедрой медицинской генетики ГОУ ВПО
«Новосибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», д. м.н., профессор;
Репликация ДНК
Объектом исследования данного метода является Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). ДНК является универсальным носителем генетической информации у всех существующих на Земле организмов (исключение - РНК-содержащие микроорганизмы). ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из соединенных последовательно нуклеотидов. Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5"-концу одной нити соответствует 3"-конец второй нити. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. Данный процесс называется репликацией . Репликация молекулы ДНК происходит в синтетический период интерфазы. Каждая из двух цепей «материнской» молекулы служит матрицей для «дочерней». После репликации вновь синтезированная молекула ДНК содержит одну «материнскую» цепочку, а вторую - «дочернюю», вновь синтезированную (полуконсервативный способ). Для матричного синтеза новой молекулы ДНК необходимо, чтобы старая молекула была деспирализована и вытянута. Репликация начинается в нескольких местах молекулы ДНК. Участок молекулы ДНК от точки начала одной репликации до точки начала другой называется репликоном .
Начало репликации активируется праймерами (затравками), состоящими из 100-200 пар нуклеотидов. Фермент ДНК-хеликаза раскручивает и разделяет материнскую спираль ДНК на две нити, на которых по принципу комплементарности при участии фермента ДНК-полимеразы собираются «дочерние» цепи ДНК. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется наличие стартового блока - небольшого начального двухцепочечного фрагмента. Стартовый блок образуется при взаимодействии праймера, с комплиментарным участком соответствующей цепи родительской ДНК. В каждом репликоне ДНК-полимераза может двигаться вдоль «материнской» нити только в одном направлении (5`=>3`).
На лидирующей нити по мере раскручивания репликона постепенно непрерывно наращивается «дочерняя» цепь. На отстающей нити дочерняя цепь синтезирует также в направлении (5`=>3`), но отдельными фрагментами по мере раскручивания репликона.
Таким образом, присоединение комплементарных нуклеотидов «дочерних» нитей идет в противоположных направлениях (антипараллельно). Репликация во всех репликонах идет одновременно. Фрагменты и части «дочерних» нитей, синтезированные в разных репликонах, сшиваются в единую нить ферментом лигазой. Репликация характеризуется полуконсервативностью, антипараллельностью и прерывистостью. Весь генном клетки реплицируется один раз за период времени, соответствующий одному митотическому циклу. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная (рис. 1).
Рис. 1. Схема репликации молекулы ДНК.
Таким образом, цикл репликации ДНК включает в себя три основные стадии:
1. расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация);
2. присоединение праймеров;
3. достраивание цепи дочерней нити.
Принцип метода ПЦР
Именно репликация ДНК легла в основе ПЦР. В ПЦР перечисленные выше процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании раствора до 93-95°С происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу - присоединению или "отжигу" праймеров - инкубационную смесь охлаждают до 50-65°С. Далее смесь нагревают до 70-72°С - оптимум работы taq-ДНК-полимеразы - на этой стадии происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Другими словами метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация ) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК - полимеразой.
Наращивание дочерних нитей ДНК должно идти одновременно на обеих цепях материнской ДНК, поэтому для репликации второй цепи также требуется свой праймер. Таким образом, в реакционную смесь вносятся два праймера: один для "+"-цепи, второй для "-"-цепи. Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.
Этапы ПЦР
Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающие при различных температурных режимах (рис. 2).
· 1 этап: денатурация ДНК. Протекает при 93-95° в течение 30-40 сек.
· 2 этап: отжиг праймеров. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время отжига 20-60 сек.
· 3 этап: достраивание цепей ДНК.Комплиментарное достраивание цепей ДНК происходит от 5"-конца к 3"-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом taq-полимеразой и проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.
Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК–ампликона (рис. 3). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей.
Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2", где п - число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.
Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе ), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.
Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:
· ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);
· Праймеры (синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента). Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.
· Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК в эквивалентных концентрациях 200-500 мкм)
· Фермент Taq -полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК, 2-3 мМ).
· Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента, PH 6,8-7,8).
Для определения специфических участков генома РНК-содержащих вирусов , сначало получают ДНК-копию с РНК-матрицы, используя реакцию обратной транскрипции (RT), катализируемую ферментом ревертазой (обратной транскриптазой).
Рис. 2. Амплификация (1-ый цикл).
Рис. 3. Амплификация (2-ой цикл).
Основные области применения ПЦР
· клиническая медицина:
o диагностика инфекций,
o выявление мутаций, в том числе диагностика наследственных заболеваний,
o генотипирование, в том числе HLA-генотипирование,
o клеточные технологии
· экология (как способ мониторинга состояния и качества объектов окружающей среды и продуктов питания)
· определение трансгенных организмов (ГМО)
· идентификация личности, установление отцовства, криминалистика
· общая и частная биология,
Основные принципы
организации диагностических лабораторий
Работы в ПЦР-лаборатории проводятся согласно "Правилам устройства, техники безопасности , производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждениях системы здравоохранения.
Контаминация образцов ДНК
Проведение ПЦР-диагностики связано с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, - возможностью контаминации. Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов; ДНК-стандарта, используемого в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложноположительных результатов.
В процессе работы могут встретиться два вида контаминации :
1. перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;
2. контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, т. к. в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.
Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложноположительных результатов. Определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств. Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, использующих метод ПЦР для диагностики позволяет сформулировать основные требования к организации таких лабораторий и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований позволяет исключить возможность контаминации и получения ложноположительных результатов.
Стадии проведения ПЦР анализа
Территориально разделяют, размещая их в отдельных помещениях (рис.4,5):
· Пре-ПЦР-помещение, где производится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с исследуемыми агентами, ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.
· Пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации. В этом помещении допускается использовать другие методы детекции. Желательно комнату детекции продуктов амплификации расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.
Рабочие помещения оснащены ультрафиолетовыми лампами с максимумом излучения в области 260 нм (типа ДБ-60) из расчета 2,5 Вт на 1 м3. Лампы расположены так, чтобы прямому облучению подвергались поверхности рабочих столов, оборудование и материалы, с которыми имеет контакт оператор во время проведения ПЦР-анализа. Облучение проводится в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.
Врачи-лаборанты работают в специальной лабораторной одежде, сменяемой при переходе из одного помещения в другое, и в одноразовых перчатках. Обработка одежды из разных помещений производится отдельно. На разных этапах проведения ПЦР-анализа работают различные сотрудники.
Для работы используют отдельные наборы дозаторов, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования , халатов и перчаток предназначенные для различных стадий анализа и не переносимые из одного помещения в другое. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате имеют соответствующую маркировку.
Все этапы работы проводят только с использованием одноразовых расходуемых материалов: наконечников для автоматических пипеток, пробирок, перчаток и т. д. Обязательно меняют наконечники при переходе от пробы к пробе. Необходимо использовать наконечники с фильтром - аэрозольным барьером для предотвращения попадания микрокапель раствора в пипетку. Использованные пробирки и наконечники сбрасываются в специальные контейнеры или емкости, содержащие дезинфицирующий раствор. Клинические образцы хранят отдельно от реагентов.
Для обработки и уборки рабочего места в каждом помещении имеется ватно-марлевые тампоны (салфетки), пинцет, дезинфицирующий и инактивирующий растворы.
В ПЦР-диагностической лаборатории исключается проведение работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, которые диагностируются в данной лаборатории.
Забор клинического материала
Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты.
Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.
Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150°С в течение 1 часа.
Зона детекции (другой этаж или другое здание).
Рис. 4. Устройство ПЦР-лаборатории с детекцией электрофорезом.
|
Зона детекции (другой этаж или другое здание)
Рис. 5. Устройство ПЦР-лаборатории с флуоресцентной детекцией (количественный анализ).
Рис. 6. Комната выделения ДНК. Показан настольный бокс с бактерицидной лампой.
Рис. 7. Комната амплификации.
Рис. 8. Комната детекции.
Рис. 9. Образцы крови для ДНК-диагностик наследственных заболеваний .
Хранение и транспортировка образцов
Для диагностики наследственных заболеваний образцы крови хранятся на специальных бумажных бланках или в эпиндорфах (пластиковых пробирках) в замороженном состоянии в течение длительного времени (рис. 9).
Для диагностики инфекционных заболеваний образцы находятся при комнатной температуре не более 2-х часов. При необходимости более длительного хранения пробы могут быть помещены в холодильник с температурой 2-8°С на срок не более суток. Более продолжительное хранение (до 2-х недель) допустимо в замороженном виде в морозильной камере при температуре минус 20°С. Не допускается повторное замораживание-оттаивание проб.
Если ПЦР-диагностическая лаборатория и процедурный кабинет для забора проб территориально разобщены, то транспортировка проб должна осуществляться в термосах или термоконтейнерах с соблюдением правил хранения образцов и правил транспортировки инфекционных материалов.
Выделение ДНК из образцов
Широкую распространенность получил метод твердофазной сорбции, заключающийся в добавлении лизирующего агента, содержащего раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократной отмывки и ресорбции ДНК буферным раствором. В случае обработки сыворотки, плазмы или цельной крови обычно используется метод фенольной экстракции. Метод включает депротеинизацию фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК (или РНК) этанолом или изопропанолом. Обработка производится в микроцентрифужных пробирках типа «Eppendor P» объемом 1,5 мл. Время обработки составляет 1,5-2 часа (рис.10).
Рис. 10. Выделение ДНК.
Проведение ПЦР
Определенное количество образца из обработанной клинической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку типа «Eppendorf"» объемом 0,2 или 0,5 мл. В эту же пробирку добавляется амплификационная смесь, состоящая из воды, ПЦР-буфера, раствора дНТФ, раствора праймеров и раствора Taq-полимеразы (добавляется в смесь в последнюю очередь). Как правило, объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Затем в каждую пробирку добавляется одна капля минерального масла для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе амплификации. Пробирки переносятся в программируемый термостат (амплификатор), где проводится амплификация в автоматическом режиме по заданной программе (рис. 11).
Рис. 11. Амплификатор « Thermocycler ».
Время проведения реакции в зависимости от заданной программы составляет 2-3 часа. Параллельно с опытными пробами ставятся контрольные: положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала клинического образца вносится контрольный препарат ДНК исследуемого гена. Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК вследствие контаминации и исключить учет ложноположительных результатов.
Регистрация результатов
Амплифицированный специфический фрагмент ДНК выявляют методом электрофореза в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение внедрения, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм. В зависимости от размера образующихся в результате ПЦР ампликонов используют гель с содержанием агарозы от 1,5% до 2,5%. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия. Охлажденную до 50-60°С смесь заливают в форму слоем толщиной 4-6 мм и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. Гребенки устанавливают таким образом, чтобы между дном лунок и основанием геля оставался слой агарозы 0,5-1 мм. После застывания геля в карманы наносится амплификат в количестве 5-15 мкл. Рекомендуется параллельно с контрольными и опытными пробами проводить электрофорез смеси маркеров длин фрагментов ДНК. Обычно такая смесь содержит десять фрагментов ДНК длинной 100, 200, 300 и т. д. пар оснований.
Постановка такой пробы позволяет верифицировать длину ампликонов в контрольных и опытных пробах. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером, камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин при напряженности электрического поля 10-15 В/см. При этом фронт красителя, входящего в состав реакционной смеси должен пройти не менее 3 см.
После окончания электрофореза гель переносят на стекло трансиллюминатора и просматривают в ультрафиолетовом свете. Для документирования гель фотографируют на пленку типа "Микрат 300" или регистрируют с помощью видеосистемы, соединенной с компьютером.
В первую очередь оценивают контрольные пробы. В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса. Ее электрофоретическая подвижность должна соответствовать указанной в инструкции длине ампликона.
В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие такой полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации - загрязнении используемых реагентов исследуемой ДНК или ампликоном. Опытные пробы оценивают по наличию в соответствующей дорожке полосы, которая располагается на том же уровне, что и полоса в положительной контрольной пробе. Интенсивность свечения полосы соответствует количеству исследуемой ДНК в пробе, что позволяет проводить полуколичественную оценку ПЦР. Обычно положительные результаты оценивают по четырехбальной шкале. Если же свечение полосы в опытной пробе очень слабое, то такую пробу следует переставить (рис. 12).
Рис. 12. Электрофорез в агарозном геле.
Применения ПЦР для диагностики точковых мутаций и полиморфизмов генов
Одним из ведущих направлений применения ПЦР в практическом здравоохранении является диагностика точковых мутаций и полиморфизмов генов. Выделяют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики. В тех ситуациях, когда известен ген, повреждение которого приводит к развитию наследственного заболевания, можно это повреждение обнаружить молекулярно – генетическими методами. Такие методы называются прямыми. С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеотидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100%.
Однако на практике указанные методы могут применяться при определенных условиях :
· при известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания;
· должен быть клонирован ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность.
Целью прямой ДНК-диагностики является идентификация мутантных аллелей.
Таким образом, в тех ситуациях, когда известно, какое именно повреждение ДНК приводит к наследственному заболеванию, исследуется непосредственно фрагмент ДНК, содержащий повреждение, т. е. используется прямой метод ДНК-диагностики.
Однако к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы, неизвестна их экзонно-интронная организация и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. Поэтому в тех случаях, когда локализация повреждения не известна, используется другой подход, связанный с изучением окрестности гена, ответственного за генное заболевание, в сочетании с семейным анализом, то есть используются косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных болезней.
Для выявления точковых мутаций и небольших делеций могут использоваться различные способы, однако все они основаны на использовании метода ПЦР. Данная реакция позволяет многократно умножить нуклеотидную последовательность ДНК, а затем осуществить поиск мутаций. Методы поиска фрагментов ДНК, несущих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных нуклеотидных последовательностей ДНК.
Анализ продуктов ПЦР
в процессе прямой ДНК-диагностики
Предполагает исследование конкретных особенностей амплифицорованного участка гена. Так, при заболеваниях, обусловленных экспансией тринуклеотидных повторов, продукты амплификации различаются по своей длине (отражающей различное число триплетов в изучаемом участке гена) и, как следствие – по их скорости движения в геле. Благодаря этому достигается четкое электрофоретическое разделение нормальных и мутантных аллелей и точное определение патологически удлиненного фрагмента, т. е. ДНК-диагностика болезни (рис. 13).
https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">
Рис. 14. Диагностика делеции GAG в гене DYT 1 у больных дофа-независимой дистонией (электрофорез в полиакриламидном геле). Дорожки 2,3,6 – больные; дорожки 1,4,5 – контроль. Тонкой стрелкой обозначен нормальный аллель, жирной стрелкой – мутантный более короткий аллель (делеция трех нуклеотидов).
Если исследуемый участок ДНК целиком входит в состав протяженной делеции, то ПЦР-амплификация ДНК с данного делетированного аллеля осуществляеться не будет в связи с отсутствием мест для гибридизации праймеров. При этом гомозиготная делеция будет диагностирована на основании полного отсутствия ПЦР-продукта реакции (синтез ДНК невозможен с обеих копий гена). При гетерозиготной делеции возможно выявление ПЦР-продукта, синтезированного с нормального (сохранного) аллеля, однако для достоверной диагностики такой мутации необходимо использование более сложных методов визуализации ДНК, позволяющих оценить дозу конечного ПЦР-продукта.
Для выявления точковых мутаций (чаще всего нуклеотидных замен) в определенных сайтах метод ПЦР используется в комбинации с другими методами молекулярно-генетического анализа. Если место локализации и характер предполагаемой точковой мутации точно известны, то для целенаправленного выявления такой мутации могут использоваться рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы ) – особые клеточные ферменты, выделяемые из различных штаммов бактерий.
Данные ферменты распознают специфические нуклеотидные последовательности длиной от четырех до десяти нуклеотидов. После чего осуществляют рестрикцию (лат. (разрезание) этих последовательностей в составе двунитевой молекулы ДНК. Каждая рестриктаза распознает и разрезает в фиксированном месте строго определенную, специфичную для себя нуклеотидную последовательность – сайт рестрикции (сайт узнавания).
В тех случаях, когда точковая мутация изменяет естественный сайт узнавания для определенной рестриктазы, данный фермент не сможет расщепить мутантный амплифицированный в ПЦР фрагмент. В некоторых случаях, мутация приводит к появлению нового сайта узнавания для той или иной рестриктазы, отсутствующего в норме.
В обеих ситуациях мутантный и нормальный ПЦР-продукты, обработанные выбранной рестриктазой, дадут различные по длине фрагменты рестрикции, что можно будет легко обнаружить при электрофорезе (рис. 15).
Таким образом, при необходимости быстрой детекции какой – либо конкретной точковой мутации задача сводится к поиску соответствующей рестриктазы, сайт узнавания которой локализован в месте нарушенной нуклеотидной последовательности. Обработка ПЦР-продуктов такой рестриктазой позволит легко дифференцировать нормальные и мутантные аллели. Рестрикционный анализ значительно упрощает обнаружение известных точковых мутаций и в настоящее время широко используется для прямой ДНК-диагностики наследственных заболеваний.
Заключительным этапом молекулярно-генетического анализа мутаций является определение нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента ДНК (секвенирование), которая сравнивается с нормой и формулируется окончательный генетический диагноз. Благодаря успехам молекулярной генетики в настоящее время разработаны методы ДНК-диагностики более 400 наследственных болезней.
Рис. 15. Выявление точковой мутации с помощью рестрикционного анализа: А – амплифицируемый участок гена, содержащий сайт рестрикции AGCT для рестрикционной эндонуклеазы Alu I . Мутация G → A изменяет данную нуклеотидную последовательность, в результате чего рестрикция ферментом AluI блокируется; Б – электрофореграмма продуктов рестрикции: дорожка 1 – гомозиготность по нормальному аллелю; дорожка 2 – гомозиготность по мутации; дорожка 3 – гетерозиготное состояние (нормальный аллель + мутация).
Диагностика наследственных болезней, основанная на прямом исследовании мутантных аллелей у больных, членов их семей или предполагаемых гетерозиготных носителей патологических мутаций, пригодна для досимптоматической и пренатальной диагностики, которая может быть применена на самых ранних стадиях развития плода, до появления каких-либо клинических или биохимических симптомов болезни.
Независимо от метода детекции мутаций точные молекулярные характеристики каждой мутации могут быть получены только путем прямого секвенирования. Для автоматизации этого процесса в последние годы широко используется специальные аппараты – секвенаторы, которые дают возможность значительно ускорить процесс считывания ДНК-информации.
Путь для более широкого применения молекулярно-биологических исследований в клинико-диагностических лабораториях открывают ускорение аналитического процесса за счет выполнения всех процедур в одном континууме, без переноса пробы, создание условий для предотвращения контаминации при параллельном исследовании ряда аналитов и при объективной регистрации результатов в каждом цикле.
Основные модификации метода ПЦР
Используются для быстрого сканирования и поиска известных генных мутаций.
Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР
Данный метод основан на одновременной амплификации в одной реакции нескольких экзонов исследуемого гена. Это позволяет проводить экономный экспресс-скрининг наиболее частых мутаций. К примеру, для быстрой диагностики носительства делеций в гене дистрофина у больных прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшена/Беккера проводится одновременная амплификация набора наиболее часто мутирующих экзонов данного гена. Поскольку эти заболевания наследуются по Х-сцепленному рецессивному типу и связаны с повреждением у мальчиков единственной Х-хромросомы, в случае протяженной делеции при электрофорезе продуктов реакции будет выявлено отсутствие одного или нескольких фрагментов ДНК (экзонов), что может служить молекулярным подтверждением диагноза. Кроме этого, путем подбора для ПЦР-амплификации конкретных участков гена возможна достаточно точная оценка общей протяженности делеции и точек разрыва гена (в плоть до экзона).
Комбинированное использование нескольких мультиплексных реакций позволяет диагностировать до 98% всех делеций, имеющих место у больных прогрессрующей мышечной дистрофией Дюшенна/Беккера. Это составляет приблизительно 60% от общего числа известных мутаций в гене дистрофина и свидетельствует о весьма высокой эффективности данного скринингового метода ДНК-диагностики дистрофинопатий (рис. 16).
Рис. 16. Прямая ДНК-диагностика мышечной дистрофии Дюшенна с помощью мультиплексной ПЦР (электрофорез в агарозном геле). У каждого из обследуемых лиц одновременно амплифицированы четыре экзона гена дистрофина (экзоны 17, 19, 44 и 45; стрелки указывают на соответствующие продукты амплификации). Дорожка 1 – контроль, дорожки 2-5 – больные мышечной дистрофией Дюшенна с различными делециями гена дистрофина (дорожки 2 и 5 – делеция экзона 45, дорожка 3 – делеция экзона 44, дорожка 4 – делеция экзона 17 и 19).
Аллель-специфическая амплификация
Метод основан на использовании двух самостоятельных пар праймеров к конкретному участку гена: один праймер в обеих парах является общим, а второй праймер в каждой паре имеет различную структуру и является комплементарным либо нормальной, либо мутантной последовательности ДНК. В результате такой реакции в растворе одновременно могут синтезироваться две разновидности ПЦР-продуктов – нормальные и мутантные. Причем дизайн используемых праймеров дает возможность четко дифференцировать нормальные и мутантные продукты амплификации по их молекулярному размеру. Данный метод является очень наглядным и позволяет верифицировать как гомо-, так и гетерозиготное носительство мутантного аллеля.
Метод сайт-направленной модификации амплифицированной ДНК
Метод основан на использовании в ПЦР так называемого mismatch-праймера (не полностью комплементарного матрице), который отличается от матричной ДНК-последовательности на один нуклеотид. В результате включения указанного праймера в состав мутантного ПЦР-продукта в нем образуется искусственно созданный сайт рестрикции для одной из рестрикционных эндонуклеаз, что позволяет провести прямую ДНК-диагностику определенной известной мутации с помощью рестрикционного анализа. Создание такого искусственного сайта рестрикции бывает необходимо в том случае, если проведенный поиск не выявил существование известного и доступного фермента, «естественный» сайт рестрикции которого затрагивается в результате появления в молекуле ДНК исследуемой мутации.
Метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT - PCR )
Данный метод используется в тех случаях, когда в качестве объекта исследования удобнее использовать не генномную ДНК, а более компактную и информационно «насыщенную» кДНК, получаемую после соответствующей обработки образцов тканей, например биопсийного материала или клеточных линий лимфоцитов, фибробластов и т. д. Важным условие здесь является экспрессия (хотя бы минимальная) нужного гена в исследуемой ткани.
На первом этапе проводится обратная транскрипция мРНК, и получаемые молекулы кДНК служат матрицей для ПЦР. В последующем амплифицированный в достаточном количестве критический участок кДНК подвергается секвенированию и другим методам мутационного скрининга, прямому электорофоретическому исследованию (выявление делеций, вставок и т. д.) либо встраиванию в экспрессионную систему с целью получения белкового продукта и его непосредственного анализа.
Данный метод особенно эффективен для детекции мутаций, ведущих к синтезу «усеченного» белка (нонсенс-мутации, мутации сплайсинга, крупные делеции) – так называемый РТТ-анализ (Protein Truncation Test). РТТ-анализ обычно используется при исследовании протяженных мультиэкзонных генов, таких как ген мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, атаксии-телеангиоэктазии или нейрофиброматоза 1 типа.
ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR, англ.)
С каждым годом в практическом здравоохранении ПЦР в реальном времени становится все более востребованным методом диагностики. Его принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация, и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории. Благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы успешно применяется в крупнейших санитарно-эпидемических, диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее сегодняшнем ("классическом") формате.
ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.
Рис. 17. ПЦР в реальном времени.
ПЦР в реальном времени использует TaqMan систему, контролирующую кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции используется зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5"-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата (рис. 17).
Основные преимущества ПЦР-Real-Time перед ПЦР с гель электрофорезом :
· Весь метод проходит в одной пробирке;
· Проведение метода занимает 1 час;
· Достаточно 1-2 рабочих комнат;
· Наряду с качественной оценкой результата появляется возможность количественной оценки (например, при назначении противовирусной терапии при СПИДе или вирусных гепатитах необходимо знать вирусную нагрузку, т. е. количество вируса на 1ед., что обеспечивает ПЦР real time);
· Резко снижается риск контаминации.
Заключение
Метод ПЦР является одним из наиболее распространенных методов молекулярно-биологических исследований. Данный метод должен применяться клиницистами осмысленно, и врач, решивший использовать ПЦР в своей, работе должен обладать определенными знаниями об особенностях и возможностях данного метода. Во-вторых, между клиницистом и ПЦР-лабораторией должна существовать тесная обратная связь, необходимая для анализа сложных случаев и выработки правильной диагностической стратегии. В-третьих, ПЦР-анализ не является панацеей в диагностике (прежде всего инфекционных заболеваний) и не заменяет существующие методы исследований, а лишь дополняет их. И главное - ПЦР не может заменить интуицию и аналитическое мышление, которыми должен обладать врач, рассчитывающий на успех.
P . S . Молекулярно-биологические исследования - смена ориентиров диагностики и лечения. С применением молекулярно-биологических методов связывают перспективу радикальной смены акцентов в лабораторной диагностике. Речь может идти не просто о своевременной информации, а об ее заблаговременном получении. Если сейчас лабораторные исследования в большинстве случаев проводятся уже при развившейся болезни и начатом лечении, то молекулярно-биологическая лабораторная информация, как ожидают, даст возможность выявить наклонность человека к некоторым видам патологии и степень чувствительности к некоторым лекарствам, что позволит обосновать предсказательный, профилактический и персонализированный характер медицины будущего.
СМЕНА ОРИЕНТИРОВ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Сегодня В будущем
Диагноз Генетический паспорт
8. Сколько рабочих комнат необходимо для работы ПЦР-лаборатории с флуоресцентной детекцией (количественный анализ, Real-Time PCR)?
9. Что такое детекция?
10. Какие методы ДНК-диагностики выделяют?
11. Работа какого фермента лежит в основе ПЦР?
12. Почему зону детекции необходимо удалять от других рабочих зон?
13. Что такое сайт рестрикции?
14. В чем отличия прямого метода ДНК-диагностики от косвенного?
15. Что такое секвенирование?
16. Что такое мультиплексная ПЦР?
17. Какие типы мутаций определяют при помощи ПЦР?
18. Что такое контаминация?
19. В чем заключается сущность метода аллель-специфической амплификации?
20. Условия хранения материала для ПЦР?
21. В каком приборе проходит амплификация?
22. В чем заключается метод обратно-транскриптазной ПЦР (RT-PCR)?
23. Что служит материалом для ПЦР-диагностики?
24. Перечислите виды контаминации?
Тесты для самоподготовки
1. Эндонуклеазные рестриктазы:
а) ферменты, «разрывающие» ДНК в строго специфических местах;
б) ферменты, сшивающие разрывы молекулы ДНК;
в) ферменты, обеспечивающие соединения, осуществляющие репарацию ДНК.
2. Амплификация генов:
3. Какой из методов молекулярной генетики применяется для диагностики болезней, обусловленных мутантным геном известной последовательности?
а) использование специфичной рестриктазы;
б) прямая детекция с использованием специфичных молекулярных зондов;
в) семейный анализ распределения нормального полиморфизма длины рестрикционных фрагментов.
4. Секвенирование ДНК:
а) идентификация последовательности оснований ДНК;
б) многократное повторение какого-либо участка ДНК;
в) выделение фрагмента ДНК, содержащего изучаемый ген.
5. Для получения образцов ДНК можно использовать :
б) ворсины хориона;
в) амниотическую жидкость;
г) клетки амниотической жидкости;
д) биоптаты кожи, мышц, печени,
е) все верно, кроме пункта «в»,
ж) все верно, кроме пункта «г»,
з) все вышеперечисленное верно.
6. Для диагностики каких мутаций применяется метод ПЦР:
а) геномные;
б) хромосомные;
в) генные (точечные).
7. Праймер это:
а) комплементарный участок ДНК;
б) синтетическая олигонуклеотидная меченая (радиоактивно или флюоресцентно) последовательность, комплементарная мутантному или нормальному гену;
в) олигонуклеотид, выполняющий роль «затравки» и инициирующий синтез полинуклеотидной цепи на ДНК- или РНК - матрице.
8. Кем был разработан принцип метода ПЦР?
б) К. Мюллис
9. Применяется ли метод ПЦР для диагностики экспансии тринуклеотидных повторов (динамического типа мутаций)?
10. В каких областях применяется ПЦР?
а) клиническая медицина;
б) определение трансгенных организмов (ГМО)
в) идентификация личности, установление отцовства, криминалистика
г) все вышеперечисленное,
д) ничего из вышеперечисленного..
Эталоны ответов: 1 – а; 2 – б; 3 – б; 4 – а; 5 – е; 6 – в; 7 – в; 8 – б; 9 – а, 10 – г.
Основная
1.Бочков генетика. Москва. ГЭОТАР, 2002.
Дополнительная
1. , Бахарев и лечение врожденных и наследственных заболеваний у детей. – Москва, 2004.
2. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование. – Москва, 2004.
3. Гинтер генетика. – Москва, 2003.
4. Горбунов основы медицинской генетики. – СПб.: Интермедика, 1999.
5. Херрингтон С., Дж. Макги. Молекулярная клиническая диагностика. – Мир, 1999.
6. Меньшиков -биологические исследования в клинической лабораторной диагностике: возможности проблемы (лекции). Клиническая лабораторная диагностика, № 3, 2006.
7. Корниенко работы ПЦР-лаборатории при поточном анализе биологического материала. Клиническая лабораторная диагностика, № 10, 2006.
8. Организация работы ПЦР-лаборатории. Методические указания. МУ 1.3.1794-03. Главный санитарный врач РФ, 2003.
9. Erlich H. A. PCR technology. – Percin-Elmer Cetus, 1993.
10. Heid C. A., Stevens J. Real time quantitative PCR. Genome Res. – № 6, 1996.
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Методическое пособие для внеаудиторной работы студентов 3-4 курсов по специальностям лечебное дело (060101) и педиатрия (060103).
ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Россия, Красноярск,
ПЦР — диагностика инфекций, современный и высокоточный способ выявления различных инфекционных заболеваний. Чем же он отличается от других анализов?
Расшифровывается эта аббревиатура как «полимеразная цепная реакция». Ее, как гласит Википедия, изобрел в 1983 году Кэри Мюллис, американский ученый. За свое открытие он получил Нобелевскую премию.
Некоторое время ПЦР использовали лишь в научных целях, после ее успешно заимствовала медицина. Суть исследования заключается в распознавании возбудителя инфекции на уровне ДНК и РНК. Каждый возбудитель, внедряясь в ДНК, изменяет его структуру по определенному типу. Именно по виду измененной ДНК лаборанту становится ясно, какое заболевание прячется в организме человека. Среди остальных преимуществ ПЦР:
- Выявление первопричины инфекции, оставившей «следы» в ДНК. При сочетании нескольких болезней выявить то, с которого все началось, трудно. А для правильной постановки диагноза и подбора эффективного лечения, цепная реакция имеет колоссальное значение;
- Устанавливается на ПЦР не только измененная ДНК, но и конкретный участок трансформации. Это необходимо для исключения сомнений по поводу ложных инфекций;
- ПЦР-диагностика настолько чувствительна, что обнаруживает даже единичные бактерии и вирусы. Они могут оставаться в крови после неправильно назначенного лечения или незапланированного прерывания приема лекарств. Минимально диагностируемое количество при расшифровке ПЦР — 10 клеток-возбудителей. Другие методики тестирования не столь действенны;
- Патогенные микроорганизмы обнаруживаются даже при отсутствии выраженных симптомов ЗППП. Обнаруженное на раннем этапе такое заболевание лечится не так длительно, как запущенные его формы;
- Результаты ПЦР больной получает на руки довольно быстро. На диагностику инфекций уходит не более 4-6 часов. Вкупе с расшифровкой весь процесс отнимает не более 1-2 дней;
- Взятого единожды ДНК-материала хватает для проведения 5-6 проб. Больному не придется сдавать мазки несколько раз;
- ПЦР и исследование инфекций не стоит на месте, данная сфера постоянно развивается. Изобретаются новые тест-системы повышенной чувствительности, снижается стоимость проведения исследования. Если раньше оно было доступно только жителям мегаполисов, то теперь без него не мыслят определение болезни врачи стационарных поликлиник в регионах.
Особенности метода ПЦР:
- Точность (ошибки минимальны и частота их не превышает 0,01%);
- Чувствительность (тест «вычисляет» единичные бактерии в крови и мазках);
- Специфичность (ПЦР выявляет инфекции, часто вовсе не проявляющие себя до тяжелой стадии);
- Уникальность (анализы результативны в ситуациях, когда другие исследования ничего не обнаруживают).
Результаты анализа ПЦР
Как работает метод цепная реакция, как подготовиться к анализу?
Цепная реакция в лабораторных условиях предполагает многократное размножение разных участков ДНК и РНК с целью нахождения того самого нарушенного звена. Амплифицируются (удваиваются) кислоты при помощи ферментных препаратов. Используя ферменты, лаборант получает достаточное число копий патогенного участка ДНК для сравнения ПЦР его с образцами тех или иных болезней, спровоцированных инфекцией.
Как правило, используются биологические материалы, взятые путем забора или мазка. Для идентификации (расшифровка венерических инфекций) на ПЦР берется мазок из влагалища, шейки матки или мочеиспускательного канала. Иногда используется также моча.
Чтобы подтвердить или опровергнуть наличие гепатита, токсоплазмоза или ВИЧ, берут кровь из вены. Кровь, забранная из пальца, часто дает ложноотрицательные результаты. Мононуклеоз диагностируют после сбора материала ил зева. Туберкулез можно выявить после сбора мокроты, которая обильно выделяется у больных в утренние часы.
Мазок из влагалища и шейки матки на ПЦР — простой анализ, пугаться которого не стоит. За 2-3 дня до его проведения нужно отказаться от половой жизни. В течение этого же времени запрещается использовать для личной гигиены гели и мыло на щелочной основе. Подмываться можно обычной теплой водой из-под крана. Последнее подмывание — вечером перед утренним посещением лаборатории или врачебного кабинета.
Лечение молочницы с помощью кремов, мазей, свечей или спреев, если оно проводится, тоже желательно прекратить. Мазок сдается в первые несколько суток после менструации или сразу после нее. Для получения более точных результатов рекомендуется не посещать туалет 2-3 часа перед забором мазка ПЦР.
У мужчин на цепную реакцию берут мазок из уретры. Биологический материал забирают с помощью стерильного зонда или ватного тампона, вводимого в мочеиспускательный канал. Во время процедуры может появиться небольшой дискомфорт или чувство жжения. Мужчинам тоже придется временно отказаться от секса и средств гигиены. За неделю до анализа прекращается лечение антибиотиками и другими препаратами. Если дискомфорт после забора сохраняется, рекомендуется скорее обратиться в поликлинику.
Допустим, в исследовании используется кровь или мазок, взятый из половых органов пациента. Генетический материал помещается в прибор-амплификатор для ПЦР, туда же добавляются ферменты. ДНК нагревается до 90-95°С до разрушения цепочки на несколько звеньев. Этот процесс называется денатурацией. Во время работы реактора из одного образца ДНК и РНК создаются тысячи пригодных для анализа (расшифровка реакции) результата его копий.
Результаты диагностики ПЦР
Цепная реакция показывает не только наличие инфекции, но и точное количество имеющихся возбудителей. Разработка последних лет — искусственное введение мутационных генов в ДНК человека с целью выявления предрасположенности к изменению генотипа.
Что выявляет диагностика инфекций ПЦР?
Расшифровка результатов анализа обычно просматривается отдельно лечащим врачом. Возможности цепной реакции позволяют подтвердить или опровергнуть наличие следующих болезней:
Как ясно из этого списка, ПЦР диагностика дарит врачам многих узконаправленных специальностей неограниченные возможности. Применять метод можно в пульмонологии, вирусологии, инфекциологии, онкологии, гастроэнтерологии, гематологии, гинекологии и урологии.
ПЦР расшифровка: результаты
Анализы цепной реакции оцениваются только врачами индивидуально для каждого пациента с учетом имеющихся патологий и хронических болезней. Результаты анализов ПЦР указывают, как уже сказано выше, на количественные характеристики патогенных бактерий. Сверяясь с ними, врач установит степень тяжести и стадию заболевания. Исходя из этих показателей, в дальнейшем назначается дозировка препаратов и длительность курса приема.
Отрицательный результат ПЦР означает, что в забранном биологическом материале отсутствуют проявления каких-либо вирусов и инфекций. Положительный ПЦР — сигнал к тревоге. Значит, в крови и других биологических жидкостях пациента обнаружена инфекция.
Если значения минимальные, это может свидетельствовать о простом носительстве болезни, а не только об активном развитии заболевания. Простой переносчик инфекции, обнаруженный только при ПЦР, но не выказывающий никаких других симптомов, должен постоянно наблюдаться у врача.
Важно не поддаваться панике и помнить о том, что большая часть известных науке вирусов поддается лечению антибактериальными препаратами. Подбирать их и заменять один другим при неэффективности может только квалифицированный специалист, имеющий опыт в лечении той или иной болезни.
Расшифровка ПЦР может быть проведена не только по требованию врача, но и по собственному волеизъявлению. Часто его делают женщины, планирующие в ближайшее время беременность, чтобы убедиться в отсутствии венерических заболеваний. При постановке на учет в районной консультации у беременной все равно возникнет необходимость в прохождении этого типа диагностики.
Назначают ПЦР в обязательном порядке женщинам, имевшим несколько абортов или выкидышей по разным причинам. Перед ЭКО проводят анализ для устранения всех причин возможного отторжения плодного яйца.
Мужчины склонны проводить ПЦР после отпуска, во время которого имел место курортный роман или даже несколько. Диагностика помогает им не ставить под угрозу свою жизнь и здоровье потенциальных сексуальных партнерш.
Часто ПЦР становится единственным шансом для пациента избавиться от болезни на начальном этапе, когда ничтожен риск осложнений и тяжелого течения.
В современной медицине проведение ПЦР анализа биологических жидкостей организма является высокоточным и информативным. При помощи данного анализа выявляют наличие в организме вирусных и микробных частиц, даже если болезни протекают скрыто и не дают никаких симптомов.
Что значит назначение вам ПЦР анализа? Эта аббревиатура расшифровывается как метод полимеразной цепной реакции - это особый способ проведения лабораторных исследований. При данном методе полученный от пациента биологический материал размещается в специальном аппарате. К исследуемой среде прибавляют набор ферментов-реактивов, которые помогают воспроизводить генетический материал возбудителя (вируса или микроба). При реакции воспроизводится большое количество копий ДНК или РНК, что позволяет идентифицировать путем сравнения с базой данных как вирусную, так и микробную инфекцию.
Что означает результат ПЦР анализа? Если в организме человека имеется возбудитель каких-либо инфекций, даже скрытый, при данном анализе будет выявлено не только его наличие, но и в каком количестве данная инфекция присутствует в теле.
Для анализа на инфекции методом ПЦР можно исследовать все биологические жидкости организма - кровь, моча, слюна, выделения половых органов, слизь горла и носа. Для анализа требуется совсем немного материала, так как если возбудители имеются, за счет воспроизведения их копий, концентрация генетической информации доводится до такой, которая выявит микроб или вирус, и определит его вид. Точность анализа ПЦР очень высока, при помощи данного анализа можно на сегодня определить практически все широко распространенные вирусные, микробные и иные инфекции.
Но, что же чаще всего выявляет анализ ПЦР? К списку инфекций, которые можно выявить данным методом можно отнести инфекционные, в том числе и социально опасные инфекции по типу туберкулеза или гепатитов В и С. Этим же методом можно выявить ВИЧ-инфекцию, хламидийную и уреаплазменную инфекции, микоплазмоз как респираторной системы, так и генитальный. При помощи данного анализа выявляют молочницу, бактериальный вагиноз, трихомониаз. Возможности данного метода позволяют выявлять скрытые инфекции - герпес разных типов, ВПЧ (папилломавирус), а также выявление особого микроба, ответственного за развития язв желудка - хеликобатера.
Сегодня сдать анализ методом ПЦР можно практически в любой частной или государственной лаборатории. Данные виды анализов проводят всем, детям и взрослым. В зависимости от того, какую цель преследует анализ, в зависимости от пола проводятся анализ разного биологического материала.
Так, анализ ПЦР у мужчин проводит по крови или моче, секрету уретры, слизи из глотки или носа, соку простаты или даже сперме. Проведение анализа ПЦР у женщин возможно в крови и моче, влагалищном секрете, выделениях из уретры, слизи носа и глотки.
Очень часто применяют анализ ПЦР при беременности, с его помощью во влагалищном секрете или крови выявляют скрытые инфекции, требующие особого наблюдения в этот период, а иногда и адекватного лечения.
ПЦР как берут анализ
Анализ на инфекции данным методом назначает врач, зачастую сбор материала проводится сразу в кабинете доктора - уролога или гинеколога. Как делается анализ ПЦР?
Исследуемый материал в лаборатории смешивают с реактивами и ждут реакции. При наличии возбудителей, копии их ДНК или РНК размножаются. Выявленные фрагменты генетического материала аппарат сравнивает с базами данных и точно выявляет возбудителя инфекции. Пи необходимости, также указывается и количество возбудителя в тех или иных жидкостях тела. Обычно исследование длится не более 1-2 суток, при необходимости - проводят экспресс-анализы.
Откуда берут анализ ПЦР? Это будет зависеть от того, какие виды возбудителя предполагаются. Если это ВИЧ или гепатиты - берется кровь, если это половые инфекции - берется мазок с уретры или влагалища. При подозрении на мононуклеоз или герпес берут мазок с горла. Также могут использоваться моча, спинномозговая жидкость, отделяемое из ран, мокрота и тд.
Анализ крови ПЦР
Для точных результатов и диагностики инфекций важно сдавать кровь в утренние часы натощак. Анализ крови методом ПЦР способен выявить возбудителей опасных заболеваний - ВИЧ, гепатиты, сифилис. В периоды обострения и активности вируса в крови могут быть выявлены вирусы герпеса, папилломы и некоторые другие.
ПЦР анализ: подготовка
Для абсолютной точности анализа важна правильная к нему подготовка. Проще всего подготовиться к анализу крови, никаких ограничений в диете или активности нет, кровь нужно сдать утром, натощак. Анализ мочи сдают после подмывания гениталий, из средней порции в специальный стерильный контейнер. Анализ ПЦР из половых путей заслуживает особого внимания, поэтому важно знать, как подготовиться. За сутки до обследования запрещается секс, перед исследованием рекомендовано не мочиться. При менструации у женщин, дата анализа переносится на 3-5 дней с момента последних выделений.
Сколько времени делается анализ ПЦР
Анализ в зависимости от возможности лаборатории может готовиться от нескольких часов до нескольких дней. В среднем, сколько дней делается анализ ПЦР? Обычно это одни -двое суток. При экстренной ситуации анализ может быть выполнен в этот же день, через несколько часов.
В наш современный век молекулярная генетика находит широкое применение в различных отраслях медицины. С момента своего зарождения она стала одним из наиболее эффективных способов постановки диагноза и позволила быстро и точно выявлять инфекции в человеческом организме. Если вам необходимо пройти ДНК диагностику в Москве, приглашаем воспользоваться услугами клиники «Евромедпрестиж». Специалисты нашего центра обладают огромным опытом в области генетического анализа и гарантируют высокоточное тестирование ДНК-материала в самые короткие сроки!
Для чего проводится ДНК диагностика в Москве
Под ДНК-диагностикой понимают обширный спектр исследований, применяемых в микробиологии для выявления инфекционных заболеваний. В последние годы вирусы и бактерии стремительно развиваются и эволюционируют, их становится больше, а установить их всё труднее и труднее. Использование генетических методов позволяет находить даже единичные микроорганизмы в исследуемом образце и определять сразу нескольких возбудителей в одной биологической пробе.
Наиболее распространенной методикой, используемой при ДНК диагностике в Москве в нашей клинике, является ПЦР (полимеразная цепная реакция). При ее проведении происходит многократное избирательное копирование отдельных участков нуклеиновой кислоты ДНК, выполняемое при помощи ферментов (сложных молекул белка). Реакция осуществляется в специальном аппарате - амплификаторе, который периодически нагревает и охлаждает пробирки с пробой, а затем отображает информацию в режиме реального времени на табло в виде графиков.
Возможности проводимого исследования достаточно велики. С его помощью удается определить большое количество заболеваний, в том числе практически все инфекции, передающиеся половым путем:
- уреаплазму;
- хламидии;
- грибы Candida;
- гарднереллу;
- трихомонаду;
- гонококки и другие.
Часто бывают ситуации, когда врачу необходимо установить эффективность проводимой терапии или степень излеченности болезни - и в этом случае ДНК диагностика в Москве становится просто незаменимой. Особенно важной она считается при наличии скрытых инфекций, которые сложно выявить посредством микроскопии.
Метод ПЦР прост в исполнении и обладает множеством преимуществ:
- Высокая специфичность - при исследовании в пробе выделяют фрагмент ДНК, который присущ только конкретному возбудителю.
- Повышенная чувствительность - инфекцию можно обнаружить даже в том случае, если в исследуемом материале имеется только одна клетка вируса или бактерии.
- Универсальность - для постановки диагноза можно применять любой биологический материал, поскольку инфекция часто содержится во всех тканях.
- Прямое выявление - в отличие от многих других методик, ПЦР помогает установить возбудителя не по косвенным признакам, а по его непосредственному присутствию в забранном материале.
- Возможность доклинического ДНК тестирования в Москве - патогены можно обнаружить еще до появления симптоматики, в том числе в инкубационный период.
0Array ( => Анализы) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2
Как подготовиться к обследованию
Для выявления возбудителя допустимо использовать различные материалы - кровь, мокроту, мочу, соскоб эпителия с влагалища, маточной шейки или уретры. Точность проводимого анализа во многом зависит от стерильности при заборе материала. Поскольку ПЦР имеет повышенную чувствительность, любые загрязнения пробы способны исказить полученный результат.
Важную роль в достоверности диагностики играет предварительная подготовка пациента к исследованию. Она не вызывает никаких затруднений и предусматривает выполнение следующих рекомендаций:
- Необходимо отказаться от приема антибиотиков за 1 месяц до сдачи анализа.
- Кровь для ДНК диагностики в нашем центре в Москве сдают натощак с утра.
- При сдаче мочи собирают ее первую утреннюю порцию в стерильный контейнер после тщательной гигиены гениталий.
- При обследовании на половые инфекции - исключают интимную жизнь за 72 часа и мочеиспускание за 3-4 часа до забора материала. С вчера предыдущего дня не следует выполнять гигиену половых органов.
Точность ДНК диагностики в Москве в нашем центре
Все тесты в стенах нашего центра проводятся исключительно дипломированными специалистами. Лаборатория оснащена передовыми достижениями в сфере тестирования ДНК, что сводит к минимуму вероятность возникновения человеческой ошибки. Высокотехнологичное оборудование, применяемое специалистами «Евромедпрестиж» для ДНК диагностики в Москве, позволяет получить результат с точностью до 97 %.
Благодаря передовым научно-техническим разработкам метод не имеет аналогов по соотношению качества и цены. При небольших затратах пациент получает возможность оперативно узнать свой диагноз и приступить к лечению выявленного заболевания еще до того, как оно начнет давать осложнения.
гастроэнтерологиядиагностический комплекс - 5 360 рублей
ТОЛЬКО В МАРТЕэкономия - 15%