Viirusnakkuste PCR. PCR diagnostika - infektsioonide analüüs

PCR analüüs - mis see on? See on tõhus molekulaarbioloogia meetod, mida kasutatakse koos juba traditsiooniliste immunoloogiliste, morfoloogiliste ja biokeemiliste uuringutega. Nakkushaigused arenevad ja arenevad nagu inimkond ise. Iga aastaga tuleb neid aina juurde ja nende diagnoosimine on järjest keerulisem. Haiguste ilmnemist provotseerivad ja nende arengut mõjutavad tegurid kohanduvad järk-järgult ka ümbritsevate välistingimustega, muutudes koos nendega. See oli põhjus, miks meditsiinis hakkasid ilmuma uued meetodid ja tehnoloogiad, mis aitavad saada täpsemaid tulemusi konkreetse haiguse diagnoosimisel.

See nakkushaiguste laboratoorse diagnoosimise meetod põhineb nakkuse tekitaja tuvastamisel, mida arst uurimismaterjalis kahtlustab. Polümeraasi ahelreaktsioon tuvastab need, tuvastades patsiendilt võetud proovides sobiva geneetilise materjali (RNA või DNA).

PCR-i leiutas Ameerika teadlane Cary Mullis 1983. aastal.

Enamik infektsioone allub ravile hästi, kui need avastatakse varases arengujärgus. Seetõttu on PCR meetod nii tõhus, kuna suudab tuvastada isegi viiruseid või baktereid, mille rakud on materjalis üksikud. Veelgi enam, selline diagnoos määrab viiruse, määrab selle välimuse olemuse, jõu, millega see keha mõjutab, isegi mikroobide arvu patsiendi kehas. Kogu polümeraasi ahelreaktsiooni meetodil saadud teavet saab arst rakendada, et valida sobivad ravimid ja määrata sobiv ravi.

PCR uuring

Tööpõhimõtte järgi toimub kõik üsna lihtsalt. Patsiendilt võetud bioloogiline materjal asetatakse spetsiaalsesse reaktorisse. Seejärel lisatakse sellised spetsiifilised ensüümid, mis suudavad seonduda materjalis oleva mikroobi DNA-ga ja sünteesida selle koopiat.

Kopeerimine toimub ahelreaktsiooni põhimõttel. See tähendab, et kogu protsess nõuab mitut etappi. Esiteks moodustab 1 DNA molekul 2 uut molekuli, siis neist 4 uut ja nii edasi kuni sadade ja tuhandete koopiateni. Pärast seda viiakse läbi analüüs ja selle dekodeerimine.

Mikroobsed DNA fragmentid võivad sisalduda erinevates bioloogilistes materjalides:

• bioloogilistes vedelikes (süljes, liigeses, amnionivedelikus, pleura-, tserebrospinaalvedelikus, eesnäärmemahlas);
• veres ja selle seerumis, plasmas;
• epiteelirakkude kraapimisel (kraapimine emakakaelakanalist, kusiti - nii naistele kui meestele);
• uriinis (analüüs nõuab hommikust uriini, nimelt selle esimest portsjonit);
• rögas;
• limas ja muudes bioloogilistes sekretsioonides;
• mao ja kaksteistsõrmiksoole biopaatides.

Milliseid haigusi saab PCR abil tuvastada?

Arstid peavad seda tüüpi diagnoosi üheks kõige täpsemaks. See uuring võimaldab tuvastada peaaegu kõiki viirushaigusi, mis praegu meditsiinile teada on. Väga oluline aspekt on asjaolu, et nende hulgas on infektsioone, mis elavad inimkehas aastaid, kuid ei avaldu kuidagi. Nad lihtsalt kasvavad ootuses, millal on neil kõige mugavam ennast avaldada (langus immuunsus, keha kurnatus jne). Selliste varjatud infektsioonide avastamine on eriti oluline uroloogilistes ja günekoloogilistes piirkondades.

Siin on mõned haigused, mida sageli analüüsitakse polümeraasi ahelreaktsiooni abil:

• B- ja C-hepatiit;
• paljud sugulisel teel levivad haigused (klamüüdia diagnoos, ureaplasmoos, mükoplasmoos, suguelundite kandidoos, bakteriaalne vaginoos, trihhomonoos, nakkuslik mononukleoos, inimese papilloomiviiruse infektsioon (HPV), AIDS jne);
• herpesinfektsioon (sh genitaalherpes);
• tuberkuloos ja helikobakterioos.

PCR-meetod annab häid tulemusi, sest enamikule nendest haigustest on iseloomulik, et nende sümptomid (eriti varases staadiumis) ei ole eriti märgatavad. Kuid nende tagajärjed kehale on väga negatiivsed ja sageli tervisele ja isegi elule väga ohtlikud.

Näiteks võivad sugulisel teel levivad haigused oluliselt suurendada naise võimalust haigestuda emakakaelavähki, kahjustada rasedust või põhjustada viljatust. Lisaks sõltub tema sündimata lapse tervis ema tervisest. Seetõttu on vähimagi latentse infektsiooni kahtluse korral väga oluline anda õigeaegselt verd diagnoosimiseks, et vältida loote nakatumist patogeenide tungimise kaudu. Meeste jaoks pole tagajärjed vähem negatiivsed: spermatosoidide liikuvuse ja elujõulisuse vähenemine, meeste viljatuse ja prostatiidi areng, ureetra kahjustus jne.

Selline analüüs on väga asjakohane ka viirusliku hepatiidi, tuberkuloosi ja erinevate sooleinfektsioonide õigeaegseks avastamiseks. Kui on vaja kohest ravi, on väga oluline mõista, milline patogeen on keha tabanud ja millega tuleb võidelda. Patsiendi veri või mõni muu bioloogiline materjal aitab panna täielikku ja õiget diagnoosi ning määrata ravi, mis aitab võimalikult kiiresti taastada organismi funktsioonid ja soodustab taastumist.

Herpes on ka äärmiselt püsiv ja ohtlik. Mitteaktiivsest režiimist võib see kergesti minna progresseeruvaks, mõjutades kesknärvisüsteemi, mõjutades selliste kohutavate haiguste nagu meningiit ja entsefaliit tekkimist ja arengut.

Analüüsi dešifreerimine

Pärast uuringu läbiviimist võite saada kas positiivse või negatiivse tulemuse. Just positiivsed tulemused näitavad, et see või teine ​​infektsioon on teie kehas olemas. Negatiivset tulemust tõlgendatakse nii, et patsiendi kehas ei kahtlustata infektsiooni. See tähendab, et uurimiseks esitatud bioloogilisest materjalist ei leitud midagi.

Arst peaks kõik näitajad dešifreerima ja teile rääkima. Ärge ärrituge ja ärge kartke halbu tulemusi, sest reaktsioon paljastas haiguse, mis tähendab, et pärast täiendavaid uuringuid saab arst välja kirjutada täieõigusliku ravi. Peaasi on mitte ise ravida ja protsessi mitte edasi lükata.

Analüüsiks valmistumine: mida peate teadma?

Erinevate haiguste tuvastamiseks on vaja erinevaid bioloogilisi materjale. Enne PCR-i tegemist konsulteerige kindlasti vastava spetsialistiga ja valmistuge hoolikalt eelseisvaks protseduuriks.

Selleks peate rangelt järgima kõiki arsti soovitusi ja juhiseid. Ärge unustage, et verd võetakse tavaliselt tühja kõhuga. Tupest või kusitist määrdumise võtmiseks peate 1-2 päeva hoiduma seksuaalvahekorrast, õhtul läbi viima suguelundite kogu vajaliku hügieeni ja hommikul lihtsalt sooja veega loputama. Samuti on oluline lõpetada ravimite võtmine umbes nädalaks, välja arvatud juhul, kui seda arstiga arutatakse. Ja 2-3 tunni jooksul enne testi tegemist ärge urineerige. Naiste puhul tasub arvestada, et uuringu optimaalne aeg on mõni päev enne või vahetult pärast menstruatsiooni.

PCR meetod: peamised eelised ja puudused

Seda tüüpi diagnoosil on palju eeliseid.

Esiteks määratakse nakkushaiguste patogeenid erinevalt teistest traditsioonilistest laboriuuringutest nende otsese näidustuse alusel.

Teiseks on see analüüs lihtsalt universaalne, kuna selle rakendamiseks on saadaval peaaegu kõik bioloogilised materjalid, mida ükski teine ​​uurimismeetod sageli ei aktsepteeri.

On väga oluline, et selle diagnoosi tegemisel eraldataks uuritavas materjalis DNA fragment, mis on omane ainult konkreetsele patogeenile, see tähendab puhtalt spetsiifilisele viirusele või bakterile. See näitab, kui spetsiifiline see reaktsioon on.

Teine argument selle diagnostika kasuks on selle täitmise suur kiirus. Kui mis tahes kultuuriuuringud nõuavad patogeeni eraldamiseks ja kasvatamiseks rakukultuuris mitte päevi, vaid isegi nädalaid, annab see meetod tulemusi 4-5 tunni jooksul.

PCR võimaldab tuvastada mitte ainult nakkust, mis on juba haiguse tipus, vaid ka kroonilisi haigusi, mis tahes üksikuid viirusi või baktereid. Selline diagnoos on võimalik tänu meetodi väga kõrgele tundlikkusele. See peaks hõlmama ka asjaolu, et nakkus tuvastatakse isegi siis, kui analüüsiks esitatud bioloogilises materjalis on ainult üks konkreetse viiruse või bakteri rakk.

Reaktsioon valenegatiivsetele tulemustele on väga haruldane.

Kuid meetodil on ka oma puudused. Üks neist on võimalus saada valepositiivne tulemus. See on sageli tingitud asjaolust, et nakkus on juba tapetud, kuid selle epiteelirakke pole veel värskendatud, nii et reaktsioon näeb endiselt oma surnud jääke ja kloonib selle. Seetõttu tasub oodata infektsiooni surnud rakkude täielikku eemaldamist kehast (kuu kuni kaks pärast ravi) või kasutada varakult muid meetodeid: külvamist või külvamist. Hiljem on võimalik kontroll läbi viia PCR abil.

Analüüsi teine ​​nõrkus on kõigi mikroorganismide varieeruvus. See tähendab, et mõned patogeenide genotüübid, mis on organismis juba muteerunud, jäävad katsesüsteemi jaoks tabamatuks ja reaktsiooni ei toimu. Selleks tehakse selle meetodi täiustamiseks erinevaid arendusi.

Föderaalne Haridusagentuur

Riiklik õppeasutus

Erialane kõrgharidus

"Karjala Riiklik Pedagoogikaakadeemia"

Kursusetöö teemal:

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) ja selle rakendamine

Lõpetanud: üliõpilane Korjagina Valeria Aleksandrovna

Kontrollis: Karpikova Natalja Mihhailovna

Petrozavodsk 2013

Sissejuhatus

1. peatükk Kirjanduse ülevaade

1.5.4 Platooefekt

1.5.6 Võimendamine

Järeldus

Sissejuhatus

Viimased kakskümmend aastat on olnud tähistatud molekulaargeneetiliste meetodite laialdase kasutuselevõtuga bioloogia-, meditsiini- ja põllumajandusteadustes.

1970. aastate alguseks tundus, et molekulaarbioloogia oli saavutanud teatud täiuslikkuse. Sel perioodil olid molekulaargeneetiliste uuringute peamiseks objektiks mikroorganismid. Üleminek eukarüootidele esitas teadlastele täiesti uued probleemid, mida tol ajal eksisteerinud geenianalüüsi meetoditega lahendada ei suudetud. Läbimurre molekulaargeneetika arengus sai võimalikuks tänu uue katsevahendi – restriktsiooniendonukleaaside – ilmumisele. Järgnevatel aastatel hakkas kiiresti kasvama kvalitatiivselt erinevatel lähenemisviisidel põhinevate otseste DNA analüüsimeetodite arv.

Paljudel juhtudel on kaasaegsed tehnoloogiad võimaldanud alustada erinevate organismide tuuma- ja tuumavälise genoomide peenstruktuuri ja funktsionaalse korralduse uurimist sügavamal tasemel. See oli eriti oluline uute meetodite väljatöötamiseks erinevate haiguste diagnoosimiseks ja raviks. Vähem oluline polnud ka molekulaargeneetika saavutuste kasutamine populatsioonibioloogias ja aretuses populatsioonide, sortide ja tüvede geneetilise varieeruvuse tuvastamiseks ja analüüsimiseks, majanduslikult väärtuslike isendite tuvastamiseks ja sertifitseerimiseks, geneetiliselt muundatud organismide loomiseks ja muude küsimuste lahendamiseks.

Igal meetodil on oma eelised ja puudused. Pole olemas universaalset meetodit, mis suudaks lahendada kõik esilekerkivad probleemid. Seetõttu on käimasoleva uurimistöö jaoks konkreetse meetodi valik iga teadustöö üks olulisemaid etappe.

1. peatükk Kirjanduse ülevaade

1.1 Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) avastamise ajalugu

Aastal 1983 K.B. Mullis jt avaldasid ja patenteerisid polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetodi, mis pidi avaldama sügavat mõju kõikidele nukleiinhapete uurimis- ja rakendusvaldkondadele. Selle meetodi tähtsus molekulaarbioloogia ja geneetika jaoks osutus nii suureks ja ilmseks, et seitse aastat hiljem pälvis autor Nobeli keemiaauhinna.

Meetodi kasutamise alguses, pärast iga kuumutamis-jahutustsüklit, tuli reaktsioonisegule lisada DNA polümeraas, kuna see inaktiveeriti kõrgel temperatuuril, mis oli vajalik DNA heeliksi ahelate eraldamiseks. Reaktsiooniprotseduur oli suhteliselt ebaefektiivne, nõudes palju aega ja ensüümi. 1986. aastal täiustati oluliselt polümeraasi ahelreaktsiooni meetodit. On tehtud ettepanek kasutada termofiilsete bakterite DNA polümeraase. Need ensüümid osutusid termostabiilseks ja suutsid vastu pidada paljudele reaktsioonitsüklitele. Nende kasutamine võimaldas PCR-i lihtsustada ja automatiseerida. Bakteritest eraldati üks esimesi termostabiilseid DNA polümeraase Thermus aquaticusja nimega Taq- polümeraas.

Võimalus amplifitseerida mis tahes DNA segmenti, mille nukleotiidjärjestus on teada, ja saada see pärast PCR-i homogeensel kujul ja preparatiivses koguses, muudab PCR alternatiivseks meetodiks lühikeste DNA fragmentide molekulaarseks kloonimiseks. Sel juhul ei ole vaja rakendada keerukaid metoodilisi tehnikaid, mida kasutatakse geenitehnoloogias tavapärasel kloonimisel. PCR-meetodi väljatöötamine on oluliselt avardanud molekulaargeneetika ja eelkõige geenitehnoloogia metodoloogilisi võimalusi niivõrd, et see on radikaalselt muutnud ja tugevdanud paljude oma valdkondade teaduslikku potentsiaali.

1.2 Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) variandid

· Pesastatud PCR- kasutatakse reaktsiooni kõrvalsaaduste arvu vähendamiseks. Kasutage kahte paari praimereid ja viige läbi kaks järjestikust reaktsiooni. Teine praimerite paar võimendab DNA piirkonda esimese reaktsiooni produktis.

· Pööratud PCR- kasutatakse siis, kui soovitud järjestuses on teada vaid väike ala. See meetod on eriti kasulik, kui on vaja määrata naaberjärjestused pärast DNA sisestamist genoomi. Pööratud PCR rakendamiseks tehakse restriktsiooniensüümidega rida DNA-lõikusi<#"justify">polümeraasi ahelreaktsiooni praimer

· Grupispetsiifiline PCR- PCR sugulastele<#"center">1.3 Polümeraasi ahelreaktsioon

1980. aastate keskel avastatud polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) võib mõne tunni jooksul suurendada originaalproovi koopiate arvu miljoneid kordi. Iga reaktsioonitsükli jooksul moodustub algsest molekulist kaks koopiat. Kõik sünteesitud DNA koopiad võivad olla malliks uute DNA koopiate sünteesimisel järgmises tsüklis. Seega toob tsüklite korduv kordamine kaasa koopiate arvu plahvatusliku suurenemise. Arvutustest järeldub, et isegi kui on 30 tsüklit, on algse molekuli koopiate arv üle 1 miljardi. Isegi kui võtta arvesse, et iga tsükli jooksul ei dubleerita kõiki amplikone, on koopiate koguarv sellest hoolimata üsna suur näitaja.

Iga polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) tsükkel koosneb järgmistest etappidest:

· Denaturatsioon – temperatuuri tõus põhjustab kaheahelalise DNA molekuli lahtikeeramise ja jagunemise kaheks üheahelaliseks;

· Lõõmutamine – temperatuuri alandamine võimaldab praimeritel kinnituda DNA molekuli komplementaarsetele piirkondadele;

· Elongatsioon – ensüüm DNA polümeraas lõpetab komplementaarse ahela.

Valitud fragmendi amplifitseerimiseks kasutatakse kahte oligonukleotiidpraimerit (seemneid), mis külgnevad teatud DNA piirkonnaga. Praimerid orienteeritud 3 - lõpevad üksteise poole ja võimendamist vajava jada suunas. DNA polümeraas teostab üksteist täiendavate DNA ahelate sünteesi (lõpetamist), alustades praimeritest. DNA sünteesi käigus sisestatakse praimerid füüsiliselt äsja sünteesitud DNA molekulide ahelasse. DNA molekuli iga ahel, mis on moodustatud ühe praimeri abil, võib olla matriitsiks komplementaarse DNA ahela sünteesil, kasutades teist praimerit.

1.4 Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) läbiviimine

Polümeraasi ahelreaktsioon viiakse läbi spetsiaalsetes õhukeseseinalistes polüpropüleenist katseklaasides, mille suurus ühildub kasutatud termotsükleriga (võimendiga) - seadmega, mis kontrollib polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) etappide temperatuuri ja ajaomadusi. .

1.5 Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi põhimõte

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on in vitro DNA amplifikatsioonimeetod, mis suudab mõne tunni jooksul eraldada ja korrutada spetsiifilist DNA järjestust miljardeid kordi. Võimalus saada genoomi ühest rangelt määratletud piirkonnast tohutul hulgal koopiaid lihtsustab oluliselt olemasoleva DNA proovi uurimist.

Polümeraasi ahelreaktsiooni läbiviimiseks peavad olema täidetud mitmed tingimused:

1.5.1 Reaktsioonisegus mitme komponendi olemasolu

Reaktsioonisegu (PCR) põhikomponendid on: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nukleotiidtrifosfaatide (ATP, GTP, CTP, TTP), praimerite (oligonukleotiidide), analüüsitud DNA preparaadi, termostabiilse DNA polümeraasi segu. Iga reaktsioonisegu komponent on otseselt seotud polümeraasi ahelreaktsiooniga (PCR) ja reaktiivide kontsentratsioon mõjutab otseselt amplifikatsiooni kulgu.

· Tris-HCl - määrab reaktsioonisegu pH, loob puhvermahu. DNA polümeraasi aktiivsus sõltub söötme pH-st, seega mõjutab pH väärtus otseselt polümeraasi ahelreaktsiooni kulgu. Tavaliselt on pH väärtus vahemikus 8-9,5. Kõrge pH on tingitud asjaolust, et temperatuuri tõustes Tril-HCl puhvri pH langeb.

· KCl - kaaliumkloriidi kontsentratsioon kuni 50 mm mõjutab denaturatsiooni ja anniilimise protsesside kulgu, üle 50 mm kontsentratsioon inhibeerib DNA polümeraasi.

· MgCl 2- kuna DNA polümeraas on Mg 2+- sõltuv ensüüm, siis magneesiumiioonide kontsentratsioon mõjutab ensüümi aktiivsust (Mg 2+moodustab NTP-ga komplekse – just need kompleksid on polümeraasi substraadiks). Kõrge kontsentratsioon põhjustab mittespetsiifilise amplifikatsiooni suurenemist ja madal põhjustab reaktsiooni pärssimist, optimaalne (erinevate polümeraaside jaoks) on 0,5-5 mM. Lisaks mõjutab magneesiumisoolade kontsentratsioon denatureerimis- ja anniilimisprotsesside kulgu - Mg kontsentratsiooni suurenemine 2+põhjustab DNA sulamistemperatuuri tõusu (st temperatuuri, mille juures 50% kaheahelalistest DNA ahelatest lõhutakse üheahelalisteks ahelateks).

· NTP - nukleotiidtrifosfaadid on nukleiinhapete otsesed monomeerid. Ahela lõpetamise vältimiseks on soovitatav kõigi nelja nukleotiidtrifosfaadi võrdne suhe. Nende komponentide madal kontsentratsioon reaktsioonisegus suurendab komplementaarse DNA ahela konstrueerimisel esinevate vigade tõenäosust.

· Krundid – kõige optimaalsem on kasutada praimereid, mille sulamistemperatuuri erinevus ei ületa 2–4 o C. Mõnikord pikaajalisel säilitamisel temperatuuril 4 o Suure hulga külmutamise-sulatamise korral või pärast seda moodustavad praimerid sekundaarsed struktuurid - dimeerid, vähendades PCR-i efektiivsust. Selle probleemi kõrvaldamine taandub inkubeerimisele veevannis (T = 95 o C) 3 minutit ja sellele järgnev kiire jahutamine 0°-ni FROM.

· DNA preparaadid - DNA preparaadi (maatriksi) kogus ja kvaliteet mõjutavad otseselt polümeraasi ahelreaktsiooni kulgu ja parameetreid. Liigne DNA proov inhibeerib polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR). Samuti võivad polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) efektiivsust vähendada erinevate ainete lisandid DNA preparaadis: naatriumatsetaat, naatriumkloriid, isopropanool, etanool, hepariin, fenool, uurea, hemoglobiin jne.

· DNA polümeraas - väikese koguse DNA polümeraasi kasutamisel täheldatakse lõpptoote sünteesi vähenemist, mis on otseses proportsioonis fragmentide suurusega. Polümeraasi liig 2–4 korda põhjustab hajusspektrite ilmumist ja 4–16 korda madala molekulmassiga mittespetsiifiliste spektrite ilmnemist. Kasutatud kontsentratsioonide vahemik on 0,5–1,5 aktiivsusühikut 25 µl PCR segu kohta.

Lisaks PCR-i segu põhikomponentidele kasutatakse mitmeid täiendavaid aineid, mis parandavad PCR-i kvalitatiivseid ja kvantitatiivseid näitajaid: atseetamiid (5%) - põhikomponentide lahustuvuse suurenemine; betaiin (naatriumsool) - DNA polümeraasi stabiliseerimine, DNA sulamistemperatuuri alandamine, sulamistemperatuuri võrdsustamine; veise albumiin (10-100 μg / ml) - DNA polümeraasi stabiliseerumine; dimetüülsulfoksiid (1-10%) - põhikomponentide lahustuvuse suurendamine; formamiid (2-10%) - lõõmutamise spetsiifilisuse suurenemine; glütserool (15-20%) - ensüümi termilise stabiilsuse suurenemine, DNA proovi denaturatsiooni temperatuuri langus; ammooniumsulfaat - denatureerimise ja lõõmutamise temperatuuri alandamine.

1.5.2 Tsükkel ja temperatuur

Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) programmi üldvaade on järgmine:

etapp. DNA preparaadi pikaajaline esmane denaturatsioon.1 tsükkel

etapp. DNA preparaadi kiire denatureerimine. Praimeri lõõmutamine. Pikendus.30 - 45 tsüklit.

etapp. Pikaajaline pikenemine. Reaktsioonisegu jahutamine 1 tsükkel.

Igal etapi elemendil - denatureerimine, lõõmutamine, pikenemine - on individuaalsed temperatuuri- ja ajaomadused. Iga elemendi temperatuuri ja vooluaja parameetrid valitakse empiiriliselt, vastavalt võimendusproduktide kvalitatiivsetele ja kvantitatiivsetele näitajatele.

Denatureerimine. Selle polümeraasi ahelreaktsiooni elemendi käigus jagatakse kaheahelaline DNA molekul kaheks üheahelaliseks. Denaturatsiooni temperatuuriparameetrid on vahemikus 90–95 o C, kuid suure guaniini ja tsütosiini sisaldusega DNA proovi puhul tuleks temperatuuri tõsta 98 ​​kraadini. o C. Denaturatsiooni temperatuur peaks olema piisav täielikuks denatureerimiseks – DNA ahelate lõikamiseks ja "äkkjahtumise" või kiire anniilimise vältimiseks, kuid termostabiilne DNA polümeraas on kõrgetel temperatuuridel vähem stabiilne. Seega on praimeri/proovi suhte (DNA ettevalmistamise) optimaalsete denatureerimistemperatuuri parameetrite valimine amplifikatsiooni oluline tingimus. Kui denatureerimistemperatuur on esimeses etapis üle 95 o C, on soovitatav lisada reaktsioonisegule DNA polümeraas pärast esmast denatureerimist. Selle etapi elemendi kestus polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) ajal peaks olema piisav DNA täielikuks denatureerimiseks, kuid samal ajal ei tohiks see oluliselt mõjutada DNA polümeraasi aktiivsust antud temperatuuril.

Lõõmutamine. Lõõmutustemperatuur (T aga ) on polümeraasi ahelreaktsiooni üks olulisemaid parameetreid. Iga konkreetse praimeri anniilimistemperatuur valitakse individuaalselt. See sõltub praimeri pikkusest ja nukleotiidide koostisest. Tavaliselt on see 2–4 madalam o Sulamistemperatuuri väärtusest (T m ) krunt. Kui süsteemi anniilimistemperatuur on optimaalsest madalam, suureneb mittespetsiifiliste amplifitseeritud fragmentide arv ja vastupidi, kõrgem temperatuur vähendab amplifitseeritud produktide arvu. Sel juhul võib spetsiifiliste amplikonide kontsentratsioon järsult väheneda kuni polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) pärssimiseni. Lõõmutamisaja pikendamine toob kaasa ka mittespetsiifiliste amplikonide arvu suurenemise.

Pikendamine. Tavaliselt on igal termostabiilse DNA polümeraasi tüübil individuaalne aktiivsuse temperatuurioptimum. Komplementaarse DNA ahela sünteesi kiirus ensüümi poolt on samuti igale polümeraasile omane väärtus (keskmiselt on see 30–60 nukleotiidi sekundis ehk 1–2 tuhat alust minutis), seega valitakse pikenemisaeg sõltuvalt DNA polümeraasi tüübi ja amplifitseeritud piirkonna pikkuse kohta.

1.5.3 Praimeri valiku põhiprintsiibid

PCR-testisüsteemi loomisel on üks peamisi ülesandeid praimerite õige valimine, mis peavad vastama mitmele kriteeriumile:

Praimerid peavad olema spetsiifilised. Erilist tähelepanu pööratakse 3 - praimerite otsad, kuna just nendest hakkab Taq polümeraas täiendama DNA ahelat. Kui nende spetsiifilisus on ebapiisav, siis on tõenäoline, et reaktsiooniseguga katseklaasis toimuvad soovimatud protsessid, nimelt mittespetsiifilise DNA (lühikesed või pikad fragmendid) süntees. See on elektroforeesil nähtav raskete või kergete lisaribade kujul. See muudab reaktsiooni tulemuste hindamise keeruliseks, kuna spetsiifilist amplifikatsiooniprodukti on lihtne segi ajada sünteesitud võõr-DNA-ga. Osa praimeritest ja dNTP-dest kulub mittespetsiifilise DNA sünteesiks, mis põhjustab tundlikkuse märkimisväärset kaotust.

Praimerid ei tohiks moodustada dimeere ja silmuseid, st. praimerite enda või üksteise külge anniilimisel ei tohiks moodustada stabiilseid topeltkiude.

1.5.4 Platooefekt

Tuleb märkida, et spetsiifiliste võimendusproduktide kogunemisprotsess võtab eksponentsiaalselt vaid piiratud aja ja seejärel langeb selle efektiivsus kriitiliselt. See on tingitud nn platoo efektist.

tähtajaline mõju platoo kasutatakse PCR-produktide akumuleerumisprotsessi kirjeldamiseks viimastes amplifikatsioonitsüklites.

Sõltuvalt amplifikatsioonireaktsiooni tingimustest ja tsüklite arvust mõju saavutamise ajal platoo substraatide (dNTP-d ja praimerid) kasutamine, reagentide (dNTP-d ja ensüüm) stabiilsus, inhibiitorite, sealhulgas pürofosfaatide ja DNA duplekside arv, konkurents reagentide pärast mittespetsiifiliste toodete või praimer-dimeeridega, konkreetse toote kontsentratsioon , ja mittetäielik denaturatsioon amplifikatsiooniproduktide kõrgete kontsentratsioonide korral.

Mida madalam on sihtmärk-DNA algkontsentratsioon, seda suurem on reaktsiooni oht platoo". See punkt võib ilmneda enne, kui konkreetsete amplifikatsiooniproduktide arv on analüüsimiseks piisav. Seda saavad vältida ainult hästi optimeeritud testsüsteemid.

1.5.5 Bioloogilise materjali proovide ettevalmistamine

Sõltuvalt ülesannetest kasutatakse DNA ekstraheerimiseks erinevaid tehnikaid. Nende olemus seisneb DNA ekstraheerimises (ekstraheerimises) bioloogilisest tootest ja võõrlisandite eemaldamises või neutraliseerimises, et saada PCR jaoks sobiva puhtusega DNA preparaat.

Marmuri kirjeldatud puhta DNA preparaadi saamise meetodit peetakse standardseks ja see on juba muutunud klassikaliseks. See hõlmab ensümaatilist proteolüüsi, millele järgneb deproteiniseerimine ja DNA ümbersadestamine alkoholiga. See meetod võimaldab saada puhast DNA preparaati. Kuid see on üsna töömahukas ja hõlmab töötamist selliste agressiivsete ja teravate ainetega nagu fenool ja kloroform.

Üks praegu populaarseid meetodeid on DNA ekstraheerimise meetod, mille on välja pakkunud Boom et al. See meetod põhineb tugeva kaotroopse aine, guanidiintiotsüanaadi (GuSCN) kasutamisel rakkude lüüsiks ja sellele järgneval DNA sorptsioonil kandjal (klaashelmed, kobediatomiit, klaaspiim jne). Pärast pesemist jääb DNA kandjale adsorbeerunud proovi, kust seda saab elueerimispuhvriga hõlpsasti eemaldada. Meetod on mugav, tehnoloogiliselt arenenud ja sobib proovide ettevalmistamiseks võimendamiseks. Kuid DNA kadu on võimalik kandjal pöördumatu sorptsiooni tõttu, aga ka arvukate pesemiste käigus. See on eriti oluline proovis väikese koguse DNA-ga töötamisel. Lisaks võivad isegi väikesed GuSCN-i kogused pärssida PCR-i. Seetõttu on selle meetodi kasutamisel väga oluline sorbendi õige valik ja tehnoloogiliste nüansside hoolikas järgimine.

Teine proovide valmistamise meetodite rühm põhineb Chilex-tüüpi ioonivahetite kasutamisel, mis erinevalt klaasist ei adsorbeeri DNA-d, vaid vastupidi, reaktsiooni segavaid lisandeid. Reeglina sisaldab see tehnoloogia kahte etappi: proovi keetmine ja lisandite adsorptsioon ioonivahetile. Meetod on selle teostamise lihtsuse tõttu äärmiselt atraktiivne. Enamasti sobib see kliinilise materjaliga töötamiseks. Kahjuks on mõnikord proovides lisanditega, mida ei saa ioonivahetitega eemaldada. Lisaks ei saa mõningaid mikroorganisme hävitada lihtsa keetmisega. Nendel juhtudel on vaja sisse viia proovi töötlemise täiendavad etapid.

Seega tuleks proovi ettevalmistamise meetodi valikut käsitleda kavandatud analüüside eesmärkide mõistmisega.

1.5.6 Võimendamine

Amplifikatsioonireaktsiooni läbiviimiseks on vaja reaktsioonisegu ette valmistada ja sellele lisada analüüsitud DNA proov. Sel juhul on oluline arvestada praimeri lõõmutamise mõningate omadustega. Fakt on see, et analüüsitavas bioloogilises proovis on reeglina erinevaid DNA molekule, millega reaktsioonis kasutatud praimerid on osalise, mõnel juhul olulise homoloogiaga. Lisaks võivad praimerid üksteisega liituda, moodustades praimer-dimeerid. Mõlemad põhjustavad kõrvalreaktsioonide (mittespetsiifiliste) produktide sünteesiks olulist praimerite tarbimist ja vähendavad selle tulemusena oluliselt süsteemi tundlikkust. See muudab reaktsiooni tulemuste lugemise elektroforeesi ajal keeruliseks või võimatuks.

1.6 Standardse PCR reaktsioonisegu koostis

x PCR puhver (100 mM Tris-HCl lahus, pH 9,0, 500 mM KCl lahus, 25 mM MgCl2 lahus ) …….2,5 µl

Vesi (MilliQ) ………………………………………………………….18,8 µl

Nukleotiidtrifosfaatide (dNTP) segu

mM lahus iga ………………………………………….……….0,5 µl

Praimer 1 (10 mM lahus) ……………………………………………….….1 µl

Praimer 2 (10 mM lahus) …………………………………………….….1 µl

DNA polümeraas (5 ühikut / µl) ……………………………………………… 0,2 µl

DNA proov (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7 Reaktsioonitulemuste hindamine

PCR-i tulemuste õigeks hindamiseks on oluline mõista, et see meetod ei ole kvantitatiivne. Teoreetiliselt saab üksikute sihtmärk-DNA molekulide amplifikatsiooniprodukte elektroforeesiga tuvastada juba 30-35 tsükli järel. Praktikas tehakse seda aga vaid juhtudel, kui reaktsioon toimub ideaalilähedastes tingimustes, mida elus sageli ei kohta. DNA preparaadi puhtusaste mõjutab eriti palju amplifikatsiooni efektiivsust; teatud inhibiitorite olemasolu reaktsioonisegus, millest mõnel juhul võib olla äärmiselt raske vabaneda. Mõnikord ei ole nende olemasolu tõttu võimalik amplifitseerida isegi kümneid tuhandeid sihtmärk-DNA molekule. Seega puudub sageli otsene seos sihtmärk-DNA esialgse koguse ja amplifikatsiooniproduktide lõpliku koguse vahel.

2. peatükk: Polümeraasi ahelreaktsiooni rakendused

PCR-i kasutatakse paljudes valdkondades analüüsiks ja teaduslikes katsetes.

Kriminalistika

PCR-i kasutatakse niinimetatud "geneetiliste sõrmejälgede" võrdlemiseks. Vajame kuriteopaiga geneetilise materjali proovi – veri, sülg, sperma, juuksed jne. Seda võrreldakse kahtlusaluse geneetilise materjaliga. Piisab väga väikesest kogusest DNA-st, teoreetiliselt – ühest koopiast. DNA lõigatakse fragmentideks, seejärel amplifitseeritakse PCR abil. Fragmendid eraldatakse DNA elektroforeesiga. Saadud pilti DNA ribade asukohast nimetatakse geneetiliseks sõrmejäljeks.

Isaduse tuvastamine

PCR-ga amplifitseeritud DNA fragmentide elektroforeesi tulemused. Isa. Laps. Ema. Laps päris mõlema vanema geneetilise jälje mõned tunnused, mis andis uue, kordumatu jälje.

Kuigi "geneetilised sõrmejäljed" on ainulaadsed, saab perekondlikke sidemeid luua mitu sellist sõrmejälge. Sama meetodit saab väikeste muudatustega rakendada organismide vaheliste evolutsiooniliste suhete tuvastamiseks.

Meditsiiniline diagnostika

PCR võimaldab oluliselt kiirendada ja hõlbustada pärilike ja viirushaiguste diagnoosimist. Huvipakkuvat geeni amplifitseeritakse PCR-iga, kasutades sobivaid praimereid, ja seejärel sekveneeritakse mutatsioonide määramiseks. Viirusnakkusi saab avastada kohe pärast nakatumist, nädalaid või kuid enne haiguse sümptomite ilmnemist.

Personaliseeritud meditsiin

Mõnikord on ravimid mõne patsiendi jaoks mürgised või allergeensed. Selle põhjuseks on osaliselt individuaalsed erinevused ravimite ja nende derivaatide tundlikkuses ja metabolismis. Need erinevused on määratud geneetilisel tasandil. Näiteks võib ühel patsiendil teatud tsütokroom olla aktiivsem, teisel - vähem. Selleks, et teha kindlaks, milline tsütokroom konkreetsel patsiendil on, on enne ravimi kasutamist soovitatav teha PCR analüüs. Seda analüüsi nimetatakse esialgseks genotüpiseerimiseks.

Geenide kloonimine

Geenide kloonimine on geenide isoleerimise ja geenitehnoloogia manipulatsioonide tulemusena suure koguse antud geeni produkti saamine. PCR-i kasutatakse geeni amplifitseerimiseks, mis seejärel sisestatakse vektorisse, DNA tükki, mis kannab võõrgeeni samasse organismi või mõnda teise organismi, mida on lihtne kasvatada. Vektoritena kasutatakse näiteks plasmiide ​​või viiruse DNA-d. Tavaliselt kasutatakse geenide sisestamist võõrorganismi selle geeni produkti - RNA või kõige sagedamini valgu saamiseks. Nii saadakse palju valke tööstuslikes kogustes kasutamiseks põllumajanduses, meditsiinis jne.

DNA sekveneerimine

Fluorestseeruva märgise või dideoksünukleotiidide radioaktiivse isotoobiga märgistatud sekveneerimismeetodis on PCR lahutamatu osa, kuna polümerisatsiooni käigus sisestatakse DNA ahelasse fluorestseeruva või radioaktiivse märgisega märgistatud nukleotiidide derivaadid. See peatab reaktsiooni, võimaldades pärast sünteesitud ahelate eraldamist geelis määrata konkreetsete nukleotiidide asukohad.

Mutagenees

Praegu on PCR-st saanud peamine mutageneesi meetod. PCR kasutamine võimaldas mutageneesi protseduuri lihtsustada ja kiirendada, samuti muuta see usaldusväärsemaks ja reprodutseeritavamaks.

PCR-meetod võimaldas analüüsida inimese papilloomiviiruse järjestuste esinemist inimese emakakaela kasvajate biopsiate lõikudes, mis olid 40 aastat enne seda uuringut sisestatud parafiini. Pealegi oli PCR abil võimalik amplifitseerida ja kloonida mitokondriaalse DNA fragmente 7 tuhande aasta vanuste inimaju fossiilsetest jäänustest!

Inimese üksikute spermatosoidide lüsaatidel demonstreeriti võimalust analüüsida samaaegselt kahte erineval mittehomoloogsel kromosoomil paiknevat lookust. Selline lähenemine annab ainulaadse võimaluse peeneks geneetiliseks analüüsiks ning kromosoomide rekombinatsiooni, DNA polümorfismi jms uurimiseks. Üksikute spermatosoidide analüüsimeetod leidis kohe praktilise rakenduse kohtumeditsiinis, kuna haploidsete rakkude HLA tüpiseerimine võimaldab määrata isadust või tuvastada. kurjategija (HLA kompleks on inimese peamise histo-sobivuse kompleksi geenide kogum; HLA kompleksi lookused on kõrgematel selgroogsetel teadaolevatest kõige polümorfsemad: liigi sees, igas lookuses on ebatavaliselt palju erinevad alleelid – sama geeni alternatiivsed vormid).

PCR abil on võimalik tuvastada võõraste geneetiliste struktuuride integreerimise õigsust uuritavate rakkude genoomi etteantud piirkonnas. Kogu raku DNA anniilitakse kahe oligonukleotiidpraimeriga, millest üks on sisestuspunkti lähedal oleva peremees-DNA piirkonnaga komplementaarne ja teine ​​antiparalleelse DNA ahela integreeritud fragmendi järjestusega. Polümeraasi ahelreaktsioon kromosomaalse DNA muutumatu struktuuri korral kavandatavas sisestuskohas põhjustab üheahelaliste DNA fragmentide moodustumist, mille suurus on määramata, ning planeeritud sisestamise korral kaheahelaliste teadaolevate DNA fragmentide moodustumiseni. suurus, mis on määratud kahe praimeri anniilimiskohtade vahelise kaugusega. Veelgi enam, genoomi analüüsitud piirkonna amplifikatsiooni aste sõltub esimesel juhul lineaarselt tsüklite arvust ja teisel juhul eksponentsiaalselt. Ettemääratud suurusega amplifitseeritud fragmendi eksponentsiaalne akumuleerumine PCR-i käigus võimaldab seda visuaalselt jälgida pärast DNA preparaadi elektroforeetilist fraktsioneerimist ja teha ühemõttelise järelduse võõrjärjestuse sisestamise kohta kromosomaalse DNA antud piirkonda.

Järeldus

PCR meetod on praegu enim kasutatav erinevate nakkushaiguste diagnoosimise meetodina. PCR võimaldab tuvastada nakkuse etioloogiat, isegi kui analüüsiks võetud proov sisaldab vaid mõnda patogeeni DNA molekuli. PCR-i kasutatakse laialdaselt HIV-nakkuste, viirushepatiidi jne varajasel diagnoosimisel. Praeguseks ei ole peaaegu ühtegi nakkustekitajat, mida ei saaks PCR abil tuvastada.

Kasutatud kirjanduse loetelu

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Molekulaar-geneetilise analüüsi meetodid. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 lk.

2.PCR "reaalajas" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. ja jne; toim. b. n. D.V. Rebrikov; eessõna L.A. Osterman ja akad. RAS ja RAAS E.D. Sverdlov; 2. väljaanne, rev. ja täiendav - M.: BINOM. Teadmiste labor, 2009. - 223 lk.

.Patrušev L.I. Kunstlikud geneetilised süsteemid. - M.: Nauka, 2005. - 2 tonnis

.B. Glick, J. Pasternak Molekulaarne biotehnoloogia. Põhimõtted ja rakendus 589 lk, 2002.a

5.Shchelkunov S.N. geenitehnoloogia. - Novosibirsk: Sib. univ. kirjastus, 2004. - 496 lk.

Toimetanud A.A. Vorbjeva "Polümeraasi ahelreaktsioon ja selle rakendamine diagnostikas dermatovenereoloogias"; Meditsiiniuudiste agentuur - 72 lehekülge

http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - meditsiiniline ajakiri

Õpetamine

Vajad abi teema õppimisel?

Meie eksperdid nõustavad või pakuvad juhendamisteenust teile huvipakkuvatel teemadel.
Saada päring märkides teema kohe ära, et saada teada konsultatsiooni saamise võimalusest.

SEI HPE "Krasnojarski Riiklik Meditsiiniakadeemia

nime saanud Yasenetsky föderaalse tervise ja sotsiaalarengu agentuuri järgi »

IPO meditsiinigeneetika ja kliinilise neurofüsioloogia osakond

MEETODI PEAMISED PÕHIMÕTTED

POLÜMERAASI KETREAKTSIOON

Metoodiline käsiraamat 3-4 kursuse õpilastele

üldmeditsiini erialadel (060101) ja

Krasnojarsk - 2007

Shnaider, N. A., Butyanov, R. A. Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi põhiprintsiibid. Üldmeditsiini (060101) ja pediaatria (060103) erialade 3-4 kursuse üliõpilaste õppekavavälise töö metoodiline juhend. - Krasnojarsk: GOU VPO KrasGMA kirjastus, 2007. - 42lk.

Metoodiline juhend vastab täielikult riigistandardi (2000) nõuetele ja kajastab inimese pärilike haiguste diagnoosimise kaasaegse meetodi põhiaspekte - polümeraasi ahelreaktsiooni meetodit, õppematerjal on kohandatud haridustehnoloogiatele, võttes arvesse selle eripära. koolitus 3-4 kursusel arsti- ja pediaatriateaduskondades.

Arvustajad: Riikliku Kutsekõrgkooli meditsiinigeneetika osakonna juhataja

"Föderaalse Tervise ja Sotsiaalarengu Agentuuri Novosibirski Riiklik Meditsiiniülikool", meditsiiniteaduste doktor, professor;

DNA replikatsioon

Selle meetodi uurimisobjektiks on desoksüribonukleiinhape (DNA). DNA on universaalne geneetilise teabe kandja kõigis Maal eksisteerivates organismides (välja arvatud RNA-d sisaldavad mikroorganismid). DNA on kahekordne ahel, mis on keerdunud spiraaliks. Iga ahel koosneb järjestikku ühendatud nukleotiididest. DNA ahelatel on vastupidine suund: ühe ahela 5'-ots vastab teise ahela 3'-otsale. DNA ainulaadne omadus on selle võime end dubleerida. Seda protsessi nimetatakse replikatsioon. DNA molekuli replikatsioon toimub interfaasi sünteetilisel perioodil. Mõlemad "ema" molekuli kaks ahelat toimivad "tütre" mallina. Pärast replikatsiooni sisaldab äsja sünteesitud DNA molekul ühte "ema" ahelat ja teine ​​- äsja sünteesitud "tütar" (poolkonservatiivne meetod). Uue DNA molekuli matriitsi sünteesiks on vajalik vana molekuli despiraliseerimine ja venitamine. Replikatsioon algab DNA molekulis mitmes kohas. DNA molekuli lõiku ühe replikatsiooni algusest teise replikatsiooni alguseni nimetatakse replikon.

Replikatsiooni algus on aktiveeritud praimerid(seemned), mis koosneb 100-200 aluspaarist. DNA helikaasi ensüüm kerib lahti ja eraldab algse DNA spiraali kaheks ahelaks, millele vastavalt komplementaarsuse põhimõttele DNA polümeraasi ensüümi osalusel monteeritakse DNA "tütar" ahelad. Ensüümi töö alustamiseks on vajalik lähteploki olemasolu - väike esialgne kaheahelaline fragment. Algplokk moodustub siis, kui praimer interakteerub lähte-DNA vastava ahela komplementaarse piirkonnaga. Igas replikonis saab DNA polümeraas liikuda mööda "ema" ahelat ainult ühes suunas (5`=>3`).

Juhtahelal kasvab replikoni lahtikeeramisel järk-järgult pidevalt tütarahel. Mahajäänud ahelal sünteesib tütarahel ka suunas (5`=>3`), kuid replikoni lahtikerimisel eraldi fragmentidena.

Seega toimub "tütar" ahelate komplementaarsete nukleotiidide kinnitumine vastupidises suunas (antiparalleelne). Replikatsioon kõigis replikonites toimub samaaegselt. Erinevates replikonites sünteesitud "tütar" ahelate fragmendid ja osad ligeeritakse ensüümi ligaasi abil üheks ahelaks. Replikatsiooni iseloomustab poolkonservatsioon, paralleelsus ja katkestus. Kogu raku genoom replitseeritakse üks kord ajaperioodi jooksul, mis vastab ühele mitootilisele tsüklile. Replikatsiooniprotsessi tulemusena moodustub ühest DNA molekulist kaks DNA molekuli, milles üks ahel pärineb DNA algmolekulist ja teine, tütar, sünteesitakse äsja (joonis 1).

Riis. üks. DNA molekuli replikatsiooni skeem.

Seega hõlmab DNA replikatsioonitsükkel kolm peamist etappi:

1. DNA heeliksi lahtikerimine ja ahelate lahknemine (denaturatsioon);

2. kruntvärvide kinnitamine;

3. lapselõnga ahela lõpetamine.

PCR-meetodi põhimõte

PCR-i aluseks oli DNA replikatsioon. PCR-is viiakse ülaltoodud protsessid läbi katseklaasis tsüklilises režiimis. Üleminek ühest reaktsioonietapist teise saavutatakse inkubeerimissegu temperatuuri muutmisega. Kui lahus kuumutatakse temperatuurini 93–95 °C, toimub DNA denaturatsioon. Järgmise etapi – praimerite lisamise või "lõõmutamise" – jätkamiseks jahutatakse inkubatsioonisegu temperatuurini 50-65 °C. Järgmisena kuumutatakse segu temperatuurini 70-72 °C – taq-DNA polümeraasi optimaalne töö – selles etapis valmib uus DNA ahel. Seejärel kordub tsükkel uuesti. Teisisõnu PCR meetod on koopiate arvu mitmekordne suurendamine (võimendus) DNA spetsiifiline osa, mida katalüüsib ensüüm DNA polümeraas.

Tütar-DNA ahelate pikenemine peab toimuma samaaegselt mõlemal ema DNA ahelal, seega on teise ahela replikatsiooniks vaja ka oma praimerit. Seega viiakse reaktsioonisegusse kaks praimerit: üks "+"-ahela jaoks, teine ​​"-"-ahela jaoks. Pärast DNA molekuli vastassuunaliste ahelate ühendamist piirduvad praimerid selle osaga, mida hiljem korduvalt kahekordistatakse või amplifitseeritakse. Sellise fragmendi, mida nimetatakse amplikoniks, pikkus on tavaliselt mitusada nukleotiidi.

PCR etapid

Iga võimendustsükkel sisaldab 3 etappi, mis toimuvad erinevatel temperatuuritingimustel (joonis 2).

· 1. etapp: DNA denaturatsioon . See voolab 93-95° 30-40 sekundit.

· 2. etapp: praimeri lõõmutamine . Praimeri kinnitumine toimub komplementaarselt vastavate järjestustega vastassuunalistel DNA ahelatel konkreetse piirkonna piiridel. Igal praimerite paaril on oma lõõmutamistemperatuur, mille väärtused jäävad vahemikku 50-65°C. Lõõmutamise aeg 20-60 sek.

· 3. etapp: DNA ahelate pikenemine.DNA ahelate komplementaarne pikendamine toimub ahela 5" otsast 3" otsani vastassuundades, alustades praimeri kinnituskohtadest. Uute DNA ahelate sünteesi materjaliks on lahusele lisatud desoksüribonukleosiidtrifosfaadid. Sünteesiprotsessi katalüüsib ensüüm taq-polümeraas ja see toimub temperatuuril 70-72°C. Sünteesiaeg - 20-40 sek.

Esimeses amplifikatsioonitsüklis moodustunud uued DNA ahelad toimivad matriitsina teise amplifikatsioonitsükli jaoks, milles moodustub spetsiifiline amplikoni DNA fragment (joonis 3). Järgnevates amplifikatsioonitsüklites toimivad amplikonid uute ahelate sünteesi mallina.

Seega kogunevad lahusesse amplikonid vastavalt valemile 2", kus n on amplifikatsioonitsüklite arv. Seega, isegi kui alglahuses oli algselt ainult üks kaheahelaline DNA molekul, koguneb lahusesse umbes 108 amplikonimolekuli. 30-40 tsükliga See kogus on piisav selle fragmendi usaldusväärseks visuaalseks tuvastamiseks agaroosgeelelektroforeesiga.

Võimendiprotsess viiakse läbi spetsiaalses programmeeritavas termostaadis ( jalgrattur), mis vastavalt etteantud programmile muudab automaatselt temperatuure vastavalt võimendustsüklite arvule.

Võimendamiseks on vaja järgmisi komponente:

· DNA matriit(DNA või selle osa, mis sisaldab soovitud spetsiifilist fragmenti);

· Praimerid(sünteetilised oligonukleotiidid (20-30 nukleotiidipaari), mis on komplementaarsed DNA järjestustega määratud spetsiifilise fragmendi piiridel). Konkreetse fragmendi valik ja praimerite valik mängivad suurt rolli amplifikatsiooni spetsiifilisuses, mis mõjutab analüüsi kvaliteeti.

· Deoksünukleotiidtrifosfaatide (dNTP) segu(segu neljast dNTP-st, mis on materjal uute komplementaarsete DNA ahelate sünteesiks ekvivalentsetes kontsentratsioonides 200-500 mikronit)

· EnsüümTaq- polümeraas(termostabiilne DNA polümeraas, mis katalüüsib praimerite ahelate pikenemist nukleotiidsete aluste järjestikuse lisamisega sünteesitud DNA kasvavale ahelale, 2-3 mm).

· puhverlahus(ensüümi aktiivsuse säilitamiseks vajalik Mg2+ ioone sisaldav reaktsioonikeskkond, PH 6,8-7,8).

RNA viiruste genoomi spetsiifiliste piirkondade määramiseks saadakse esmalt RNA matriitsist DNA koopia, kasutades pöördtranskriptsiooni (RT) reaktsiooni, mida katalüüsib ensüüm pöördtranskriptaas (pöördtranskriptaas).

Riis. 2. Amplifikatsioon (1. tsükkel).

Riis. 3. Amplifikatsioon (2. tsükkel).

PCR peamised rakendused

kliiniline meditsiin:

o infektsioonide diagnoosimine,

o mutatsioonide tuvastamine, sh pärilike haiguste diagnoosimine,

o genotüpiseerimine, sealhulgas HLA genotüpiseerimine,

o rakutehnoloogiad

ökoloogia (viis keskkonnaobjektide ja toidu seisundi ja kvaliteedi jälgimiseks)

transgeensete organismide (GMO) määratlus

Isikutuvastus, isadus, kohtuekspertiisi

üld- ja eribioloogia,

Põhiprintsiibid

diagnostikalaborite organiseerimine

Töö PCR-laboris toimub vastavalt "Tervishoiusüsteemi sanitaar- ja epidemioloogiaasutuste laborites (osakondades, osakondades) töötamise projekteerimise, ohutuse, tööstusliku kanalisatsiooni, epideemiavastase režiimi ja isikliku hügieeni eeskirjadele.

DNA proovide saastumine

PCR-diagnostika läbiviimine on seotud probleemiga, mis on põhjustatud meetodi kõrgest tundlikkusest - võimalusest saastumine. Kui reaktsioonitorusse satub jälgi positiivset DNA-d (spetsiifilised DNA amplifikatsiooniproduktid - amplikonid; positiivse kontrollina kasutatav DNA standard; kliinilise proovi positiivne DNA), põhjustab PCR-i käigus spetsiifilise DNA fragmendi amplifikatsiooni ja selle tulemusena valepositiivsete tulemuste ilmumine.

Töö käigus võib kohtuda kahte tüüpi saastumist:

1. ristsaastumine proovist proovini (kliiniliste proovide töötlemise ajal või reaktsioonisegu väljakaevamisel), mis põhjustab juhuslike valepositiivsete tulemuste ilmnemise;

2. amplifikatsiooniproduktide saastumine(amplikonid), millel on suurim tähtsus, sest PCR protsessi käigus kogunevad amplikonid tohututes kogustes ja on ideaalsed tooted reamplifikatsiooniks.

Nõude, automaatpipettide ja laboriseadmete, laborilaudade pinna või isegi laboritöötajate nahapinna saastumise jälg amplikon viib süstemaatiliste valepositiivsete tulemusteni. Saasteallika kindlaksmääramine võib olla väga keeruline ja nõuab märkimisväärset aja- ja rahainvesteeringut. Senised kogemused diagnostikaks PCR-meetodit kasutavate laborite töös võimaldavad sõnastada põhinõuded selliste laborite töökorraldusele ja analüüside endi läbiviimisele. Nende nõuete järgimine välistab saastumise ja valepositiivsete tulemuste saamise võimaluse.

PCR analüüsi etapid

Geograafiliselt eraldatud, paigutades need eraldi ruumidesse (joonis 4.5):

· PCR-eelne ruum, kus teostatakse kliiniliste proovide töötlemine, DNA ekstraheerimine, reaktsioonisegu ettevalmistamine PCR ja PCR jaoks (tingimuste olemasolul on soovitatav ka kaks viimast etappi läbi viia täiendavas eraldi ruumis). Nendes ruumides on keelatud teha muid töid uuritavate ainetega, mille PCR diagnostika tehakse selles laboris.

· PCR-järgne ruum, kus tehakse amplifikatsiooniproduktide tuvastamine. Selles ruumis võib kasutada muid tuvastamismeetodeid. Soovitav on paigutada ruum amplifikatsiooniproduktide tuvastamiseks PCR-eelsetest ruumidest võimalikult kaugele.

Tööruumid on varustatud ultraviolettlampidega, mille maksimaalne kiirgus on umbes 260 nm (tüüp DB-60) kiirusega 2,5 W 1 m3 kohta. Lambid paiknevad nii, et töölaudade, seadmete ja materjalide pinnad, millega operaator PCR analüüsi käigus kokku puutub, satuvad otsese kiirguse kätte. Kiiritamine toimub 1 tunni jooksul enne töö algust ja 1 tunni jooksul pärast töö lõppu.

Laboriarstid töötavad spetsiaalsetes laboririietes, mida ühest ruumist teise liikudes vahetatakse, ja ühekordsetes kinnastes. Erinevate ruumide riiete töötlemine toimub eraldi. PCR analüüsi erinevates etappides töötavad erinevad töötajad.

Tööks kasutatakse eraldi dosaatorite, plastik- ja klaasnõude komplekte, laborivarustust, hommikumantleid ja kindaid, mis on mõeldud erinevate analüüsietappide jaoks ja mida ei saa ühest ruumist teise üle kanda. Igas ruumis olevad seadmed, materjalid ja inventar on vastavalt märgistatud.

Kõik tööetapid tehakse ainult ühekordselt kasutatavate kulumaterjalidega: automaatpipettide otsikud, katseklaasid, kindad jne. Proovilt proovile liikudes vahetage kindlasti otsikuid. Vajalik on kasutada aerosoolbarjäärifiltriga otsikuid, et vältida lahuse mikrotilkade sattumist pipetti. Kasutatud katseklaasid ja otsikud visatakse spetsiaalsetesse konteineritesse või desinfitseerimislahust sisaldavatesse konteineritesse. Kliinilisi proove hoitakse reaktiividest eraldi.

Töökoha töötlemiseks ja puhastamiseks on igas ruumis vati-marli tampoonid (salvrätikud), pintsetid, desinfitseerivad ja inaktiveerivad lahused.

PCR diagnostikalaboris on välistatud selles laboris diagnoositud patogeenide DNA järjestusi või geenifragmente sisaldavate rekombinantsete plasmiidide tootmise (kloonimise) ja isoleerimisega seotud tööd.

Kliinilise materjali kogumine

PCR-i jaoks uuritavaks materjaliks võivad olla epiteelirakkude, vere, plasma, seerumi, pleura- ja seljaajuvedeliku, uriini, röga, lima ja muude bioloogiliste eritiste kaabitsad, biopsiaproovid.

Materjali proovide võtmine toimub vastava profiiliga raviruumi tingimustes. Pärast proovide võtmist tuleb proovid võimalikult kiiresti viia PCR diagnostikalaborisse.

Proovide võtmisel tuleb kasutada steriilseid, eelistatavalt ühekordselt kasutatavaid instrumente ainult ühekordselt kasutatavates steriilsetes plasttorudes või klaastorudes, mida on eelnevalt töödeldud tund aega kroomiseguga, pestakse põhjalikult destilleeritud veega ja kaltsineeritakse ahjus temperatuuril 150 ° C. 1 tunniks.

Tuvastamistsoon (teine ​​korrus või teine ​​hoone).

Riis. 4. PCR laboriseade elektroforeesiga tuvastamisega.

Tuvastamistsoon (eri korrus või hoone)

Riis. viis. PCR laboriseade fluorestsentstuvastusega (kvantitatiivne analüüs).

Riis. 6. DNA ekstraheerimise ruum. Näidatud on bakteritsiidse lambiga lauakarp.

Riis. 7. võimendusruum.

Riis. 8. Tuvastamisruum.

Riis. üheksa. Vereproovid pärilike haiguste DNA diagnostikaks.

Proovide ladustamine ja transport

Pärilike haiguste diagnoosimiseks säilitatakse vereproovid spetsiaalsetel pabervormidel või epindorfides (plastkatseklaasides) pikka aega külmutatuna (joon. 9).

Nakkushaiguste diagnoosimiseks hoitakse proove toatemperatuuril mitte rohkem kui 2 tundi. Kui on vaja pikemat säilitamist, võib proovid panna külmkappi temperatuurile 2-8°C kuni 24 tunniks. Pikem säilivusaeg (kuni 2 nädalat) on aktsepteeritav sügavkülmas külmutamisel temperatuuril miinus 20°C. Proovide korduv külmutamine-sulatamine ei ole lubatud.

Kui PCR diagnostikalabor ja proovide võtmise protseduuriruum on geograafiliselt eraldatud, tuleks proove transportida termostes või termokonteinerites, järgides proovide säilitamise eeskirju ja nakkusohtlike materjalide transportimise eeskirju.

DNA ekstraheerimine proovidest

Laialt levinud on tahkefaasilise sorptsiooni meetod, mis seisneb guanidiini lahust sisaldava lüüsiva aine lisamises, DNA sorbtsioonis sorbendil, korduvas pesemises ja DNA resorptsioonis puhverlahusega. Seerumi, plasma või täisvere töötlemise puhul kasutatakse tavaliselt fenoolekstraktsiooni meetodit. Meetod hõlmab deproteiniseerimist fenooli/kloroformiga, millele järgneb DNA (või RNA) sadestamine etanooli või isopropanooliga. Töötlemine toimub Eppendor P tüüpi mikrotsentrifuugi katseklaasides mahuga 1,5 ml. Töötlemisaeg on 1,5-2 tundi (joon. 10).

Riis. 10. DNA eraldamine.

PCR läbiviimine

Töödeldud kliinilisest proovist kantakse teatud kogus proovi spetsiaalsesse Eppendorfi tüüpi mikrotsentrifuugi tuubi mahuga 0,2 või 0,5 ml, millele lisatakse amplifikatsioonisegu, mis koosneb veest, PCR puhvrist, dNTP lahusest, praimeri lahusest ja lahusest. sama katsuti Taq polümeraas (lisatakse segule viimasena) Tavaliselt on reaktsioonisegu maht 25 µl Seejärel lisatakse igasse katsutisse üks tilk mineraalõli, et vältida reaktsioonisegu aurustumist amplifikatsiooni ajal. programmeeritav termostaat (võimendi), kus võimendamine toimub automaatrežiimis vastavalt etteantud programmile (joon. 11).

Riis. üksteist. Võimendi" Termoratas ».

Reaktsiooniaeg olenevalt etteantud programmist on 2-3 tundi. Paralleelselt katseproovidega paigutatakse kontrollproovid: positiivne kontroll sisaldab kõiki reaktsiooni komponente, kuid kliinilise proovi materjali asemel võetakse kasutusele uuritava geeni kontroll-DNA preparaat. Negatiivne kontroll sisaldab kõiki reaktsiooni komponente, kuid kliinilise materjali või DNA preparaadi asemel lisatakse sobiv kogus deioniseeritud vett või ekstrakti, mis ei sisalda uuritavat DNA-d. Negatiivne kontroll on vajalik, et kontrollida reaktsiooni komponentide DNA puudumist saastumise tõttu ja välistada valepositiivsed tulemused.

Tulemuste registreerimine

Amplifitseeritud spetsiifiline DNA fragment tuvastatakse agaroosgeelelektroforeesiga etiidiumbromiidi juuresolekul. Etiidiumbromiid moodustab DNA fragmentidega stabiilse interstitsiaalse ühendi, mis ilmneb helendavate ribadena, kui geeli kiiritatakse UV-kiirgusega lainepikkusega 290-330 nm. Sõltuvalt saadud PCR amplikonide suurusest kasutatakse geeli, mis sisaldab 1,5% kuni 2,5% agaroosi. Agaroosgeeli valmistamiseks sulatatakse agaroosi, puhvri ja vee segu mikrolaineahjus või veevannis ning lisatakse etiidiumbromiidi lahus. Temperatuurini 50-60°C jahutatud segu valatakse vormi 4-6 mm paksuse kihina ning spetsiaalsete kammide abil tehakse geelisse proovi pealekandmiseks taskud. Kammid asetatakse nii, et süvendite põhja ja geeli aluse vahele jääb 0,5-1 mm suurune agaroosikiht. Pärast geeli kõvenemist kantakse taskutele amplifikaat koguses 5-15 µl. Paralleelselt kontroll- ja katseproovidega on soovitatav läbi viia DNA fragmendi pikkuse markerite segu elektroforees. Tavaliselt sisaldab selline segu kümmet 100, 200, 300 jne pikkust aluspaari DNA fragmenti.

Sellise proovi seadistamine võimaldab teil kontrollida amplikonide pikkust kontroll- ja katseproovides. Geel koos pealekantud prooviga viiakse puhvriga täidetud elektroforeesikambrisse, kamber ühendatakse toiteallikaga ja amplifikatsiooniproduktide elektroforeetiline eraldamine toimub 30-45 minuti jooksul elektrivälja tugevusega 10-15. V/cm. Sel juhul peab reaktsioonisegu osaks oleva värvaine esiosa läbima vähemalt 3 cm.

Pärast elektroforeesi lõppu kantakse geel transilluminaatori klaasile ja vaadeldakse ultraviolettvalguses. Dokumenteerimiseks pildistatakse geel Mikrat 300 filmile või salvestatakse arvutiga ühendatud videosüsteemi abil.

Esmalt hinnatakse kontrollproove. Positiivsele kontrollile vastavas elektroforeesirajas peaks olema oranž helendav riba. Selle elektroforeetiline liikuvus peaks vastama juhistes määratud amplikoni pikkusele.

Negatiivsele kontrollile vastavas elektroforeesirajas peaks selline riba puuduma. Sellise riba olemasolu negatiivses kontrollis viitab saastumisele – kasutatud reaktiivide saastumisele uuritava DNA või amplikoniga. Testitavaid proove hinnatakse riba olemasolu vastaval rajal, mis asub positiivse kontrollproovi ribaga samal tasemel. Riba helendav intensiivsus vastab proovis uuritava DNA kogusele, mis võimaldab PCR-i poolkvantitatiivselt hinnata. Tavaliselt hinnatakse positiivseid tulemusi neljapallisel skaalal. Kui katseproovis oleva riba kuma on väga nõrk, tuleks selline proov ümber korraldada (joonis 12).

Riis. 12. Elektroforees agaroosgeelis.

PCR rakendusedpunktmutatsioonide ja geenipolümorfismide diagnostika

Üks juhtivaid PCR rakendusvaldkondi praktilises tervishoius on punktmutatsioonide ja geenipolümorfismide diagnoosimine. . On olemas otsesed ja kaudsed DNA diagnostika meetodid. Nendes olukordades, kus on teada geen, mille kahjustus viib päriliku haiguse tekkeni, saab seda kahjustust tuvastada molekulaargeneetiliste meetoditega. Selliseid meetodeid nimetatakse otsesteks. Otseste meetoditega tuvastatakse häired DNA primaarses nukleotiidjärjestuses (mutatsioonid ja nende tüübid). Otseseid meetodeid iseloomustab täpsus, mis ulatub peaaegu 100% -ni.

Kuid praktikas saab neid meetodeid teatud tingimustel rakendada.:

päriliku haiguse tekke eest vastutava geeni teadaoleva tsütogeneetilise lokaliseerimisega;

Haigusgeen peab olema kloonitud ja teada selle nukleotiidjärjestus.

DNA otsese diagnostika eesmärk on tuvastada mutantseid alleele.

Seega nendes olukordades, kus on teada, milline DNA kahjustus viib päriliku haiguseni, uuritakse kahjustust sisaldavat DNA fragmenti otse ehk siis kasutatakse DNA diagnostika otsemeetodit.

Tänaseks on aga paljude haiguste geenid kaardistamata, nende ekson-introni korraldus on teadmata ning paljusid pärilikke haigusi iseloomustab väljendunud geneetiline heterogeensus, mis ei võimalda täiel määral kasutada DNA otseseid diagnostikameetodeid. Seetõttu kasutatakse juhtudel, kui kahjustuse lokaliseerimine ei ole teada, teistsugust lähenemist, mis on seotud geenihaiguse eest vastutava geeni läheduse uurimisega koos perekonnaanalüüsiga, st molekulaargeneetilise diagnoosi kaudsete meetoditega. kasutatakse pärilikke haigusi.

Punktmutatsioonide ja väikeste deletsioonide tuvastamiseks saab kasutada erinevaid meetodeid, kuid kõik need põhinevad PCR meetodi kasutamisel. See reaktsioon võimaldab teil DNA nukleotiidjärjestust korduvalt korrutada ja seejärel mutatsioone otsida. Mutatsioone kandvate DNA fragmentide otsimise meetodid põhinevad mutantsete ja normaalsete DNA nukleotiidjärjestuste võrdleval analüüsil.

PCR-produktide analüüs

otsese DNA diagnostika protsessis

See hõlmab geeni amplifitseeritud piirkonna spetsiifiliste tunnuste uurimist. Seega on trinukleotiidi korduste laienemisest põhjustatud haiguste korral erinevad amplifikatsiooniproduktid oma pikkuse (peegeldades erinevat arvu kolmikute arvu uuritavas geenipiirkonnas) ja sellest tulenevalt ka liikumiskiiruse poolest geelis. Tänu sellele saavutatakse normaalsete ja mutantsete alleelide selge elektroforeetiline eraldamine ning patoloogiliselt pikliku fragmendi täpne määramine, st haiguse DNA-diagnoos (joon. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Riis. neliteist. Kustutuse diagnoos GAG geenis DYT 1 dopa-sõltumatu düstooniaga patsientidel (polüakrüülamiidgeelelektroforees). Rajad 2,3,6 - haiged; rajad 1,4,5 - kontroll. Õhuke nool tähistab normaalset alleeli, paks nool tähistab mutantset lühemat alleeli (kolme nukleotiidi deletsioon).

Kui uuritav DNA piirkond on täielikult hõlmatud laiendatud deletsiooniga, siis praimeri hübridisatsiooni kohtade puudumise tõttu ei teostata selle kustutatud alleeli DNA PCR-i amplifikatsiooni. Sel juhul diagnoositakse homosügootne deletsioon reaktsiooni PCR produkti täieliku puudumise põhjal (DNA süntees on geeni mõlemast koopiast võimatu). Heterosügootse deletsiooniga on võimalik tuvastada normaalsest (ohutust) alleelist sünteesitud PCR-produkti, kuid sellise mutatsiooni usaldusväärseks diagnoosimiseks on vaja kasutada keerukamaid DNA visualiseerimismeetodeid, mis võimaldavad hinnata lõplik PCR produkt.

Punktmutatsioonide (kõige sagedamini nukleotiidide asenduste) tuvastamiseks teatud kohtades kasutatakse PCR-meetodit koos teiste molekulaargeneetilise analüüsi meetoditega. Kui kavandatava punktmutatsiooni lokaliseerimiskoht ja olemus on täpselt teada, siis sellise mutatsiooni sihipäraseks tuvastamiseks restriktsiooni endonukleaasid (piirab) on spetsiaalsed rakulised ensüümid, mis on eraldatud erinevatest bakteritüvedest.

Need ensüümid tunnevad ära spetsiifilised nukleotiidjärjestused, mille pikkus on vahemikus neli kuni kümme nukleotiidi. Seejärel teostatakse nende järjestuste restriktsioon (lat. (lõikamine)) kaheahelalise DNA molekuli osana.Iga restriktsiooniensüüm tunneb ära ja lõikab kindlas kohas ära rangelt määratletud spetsiifilise nukleotiidjärjestuse – piirangusait (tuvastuskoht).

Juhtudel, kui punktmutatsioon muudab teatud restriktsiooniensüümi loomulikku äratundmiskohta, ei suuda see ensüüm mutantset PCR-ga amplifitseeritud fragmenti lõhustada. Mõnel juhul põhjustab mutatsioon konkreetse restriktsiooniensüümi uue äratundmissaidi ilmumise, mis normis puudub.

Mõlemas olukorras annavad valitud restriktsiooniensüümiga töödeldud mutantsed ja normaalsed PCR produktid erineva pikkusega restriktsioonifragmente, mida saab kergesti tuvastada elektroforeesiga (joonis 15).

Seega, kui on vaja kiiresti tuvastada mõni konkreetne punktmutatsioon, taandub ülesanne vastava restriktsiooniensüümi otsimisele, mille äratundmissait paikneb häiritud nukleotiidjärjestuse kohas. PCR-produktide töötlemine selle restriktsiooniensüümiga võimaldab normaalsete ja mutantsete alleelide hõlpsat eristamist. Restriktsioonianalüüs lihtsustab oluliselt teadaolevate punktmutatsioonide tuvastamist ja seda kasutatakse praegu laialdaselt pärilike haiguste otseseks DNA diagnoosimiseks.

viimane etapp mutatsioonide molekulaargeneetiline analüüs on uuritava DNA fragmendi nukleotiidjärjestuse määramine (sekveneerimine), mida võrreldakse normiga ja sõnastatakse lõplik geneetiline diagnoos. Tänu molekulaargeneetika edusammudele on tänaseks välja töötatud DNA diagnostikameetodid enam kui 400 päriliku haiguse jaoks.

Riis. 15. Punktmutatsiooni tuvastamine restriktsioonianalüüsi abil: A - restriktsioonisaiti sisaldava geeni amplifitseeritav piirkondAGCTrestriktsiooni endonukleaasi jaoksAlu ma. MutatsioonG→ Amuudab seda nukleotiidjärjestust, mille tulemuseks on restriktsiooniensüümAluiblokeeritud; B - restriktsiooniproduktide elektroferogramm: rada 1 - homosügootsus normaalse alleeli suhtes; rada 2, mutatsiooni homosügootsus; rada 3 - heterosügootne seisund (normaalne alleel + mutatsioon).

Mutantsete alleelide otsesel uurimisel põhinev pärilike haiguste diagnoosimine patsientidel, nende pereliikmetel või patoloogiliste mutatsioonide oletatavatel heterosügootsetel kandjatel on sobiv presümptomaatiliseks ja sünnieelseks diagnoosimiseks, mida saab rakendada loote arengu kõige varasemates staadiumides, enne loote arengu algust. mis tahes kliinilised või biokeemilised sümptomid, haigus.

Olenemata mutatsioonide tuvastamise meetodist saab iga mutatsiooni täpset molekulaarset iseloomustada ainult otsese sekveneerimisega. Viimastel aastatel on selle protsessi automatiseerimiseks laialdaselt kasutatud spetsiaalseid seadmeid – sekvensereid, mis võimaldavad oluliselt kiirendada DNA info lugemise protsessi.

Tee molekulaarbioloogiliste uuringute laiemaks rakendamiseks kliinilistes diagnostikalaborites avab analüütilise protsessi kiirendamine, teostades kõik protseduurid ühes kontiinumis, ilma proovi ülekandmiseta, luues tingimused saastumise vältimiseks mitmete analüütide paralleelsel testimisel ja objektiivse registreerimisega. tulemustest igas tsüklis.

PCR-meetodi peamised modifikatsioonid

Kasutatakse teadaolevate geenimutatsioonide kiireks skannimiseks ja otsimiseks.

Multipleksne (multipraimer) PCR

See meetod põhineb uuritava geeni mitme eksoni samaaegsel amplifikatsioonil ühes reaktsioonis. See võimaldab kõige levinumate mutatsioonide säästlikku kiiret sõelumist. Näiteks progresseeruva Duchenne/Beckeri lihasdüstroofiaga patsientidel düstrofiini geeni deletsioonide kandmise kiireks diagnoosimiseks viiakse läbi selle geeni kõige sagedamini muteerivate eksonite komplekti samaaegne amplifikatsioon. Kuna need haigused on päritud X-seotud retsessiivsel tüübil ja neid seostatakse poiste ainsa X-kromosoomi kahjustusega, siis pikendatud deletsiooni korral näitab reaktsiooniproduktide elektroforees ühe või mitme DNA fragmendi (eksoni) puudumist. ), mis võib olla diagnoosi molekulaarne kinnitus. Lisaks on PCR amplifikatsiooniks spetsiifiliste geenipiirkondade valimisel võimalik üsna täpselt hinnata deletsiooni ja geeni murdepunktide kogupikkust (kuni eksonini).

Mitme multipleksreaktsiooni kombineeritud kasutamine võimaldab diagnoosida kuni 98% kõigist progresseeruva Duchenne/Beckeri lihasdüstroofiaga patsientidel esinevatest deletsioonidest. See on ligikaudu 60% düstrofiini geeni teadaolevate mutatsioonide koguarvust ja näitab selle sõelumismeetodi väga suurt efektiivsust düstrofinopaatia DNA diagnoosimisel (joonis 16).

Riis. 16. Duchenne'i lihasdüstroofia otsene DNA-diagnoos, kasutades multipleksset PCR-i (agaroosgeelelektroforees). Igas uuritud isikus amplifitseeriti korraga neli düstrofiini geeni eksonit (eksonid 17, 19, 44 ja 45; nooled näitavad vastavaid amplifikatsiooniprodukte). Rada 1 - kontroll, rajad 2-5 - Duchenne'i lihasdüstroofiaga patsiendid düstrofiini geeni erinevate deletsioonidega (rajad 2 ja 5 - eksoni 45 deletsioon, rada 3 - eksoni 44 deletsioon, rada 4 - eksoni 17 ja 19 deletsioon ).

Alleelispetsiifiline amplifikatsioon

Meetod põhineb kahe sõltumatu praimeripaari kasutamisel geeni kindla piirkonna jaoks: üks praimer mõlemas paaris on ühine ja teine ​​praimer igas paaris on erineva struktuuriga ja komplementaarne kas normaalsete või mutantsete DNA järjestustega. . Sellise lahuses toimuva reaktsiooni tulemusena saab üheaegselt sünteesida kahte tüüpi PCR-produkte - normaalseid ja mutantseid. Veelgi enam, kasutatavate praimerite disain võimaldab selgelt eristada normaalseid ja mutantseid amplifikatsiooniprodukte nende molekuli suuruse järgi. See meetod on väga selge ja võimaldab teil kontrollida mutantse alleeli nii homo- kui ka heterosügootset kandmist.

Meetod amplifitseeritud DNA saidipõhiseks muutmiseks

Meetod põhineb PCR-is niinimetatud mittesobiva praimeri (ei ole täielikult komplementaarne matriitsiga) kasutamisel, mis erineb matriitsi DNA järjestusest ühe nukleotiidi võrra. Määratud praimeri lisamise tulemusena mutantse PCR-produkti koostisesse moodustub selles ühe restriktsiooniendonukleaasi jaoks kunstlikult loodud restriktsioonisait, mis võimaldab teatud teadaoleva mutatsiooni otsest DNA diagnoosimist restriktsioonianalüüsi abil. Sellise kunstliku restriktsioonisaidi loomine võib osutuda vajalikuks, kui otsing ei tuvastanud teadaoleva ja ligipääsetava ensüümi olemasolu, mille "looduslikku" restriktsioonisaiti mõjutab uuritava mutatsiooni ilmnemine DNA molekulis. .

Pöördtranskriptaasi PCR meetod (RT- PCR)

Seda meetodit kasutatakse juhtudel, kui uurimisobjektina on mugavam kasutada mitte genoomset DNA-d, vaid kompaktsemat ja informatiivsemat "küllastunud" cDNA-d, mis on saadud pärast koeproovide, näiteks biopsia materjali või lümfotsüütide rakuliinide asjakohast töötlemist. , fibroblastid jne. Oluline tingimus on siin soovitud geeni ekspressioon (vähemalt minimaalne) uuritavas koes.

Esimeses etapis viiakse läbi mRNA pöördtranskriptsioon ja saadud cDNA molekulid toimivad PCR matriitsina. Seejärel teostatakse piisavas koguses amplifitseeritud kriitilise cDNA piirkonnaga sekveneerimine ja muud mutatsiooni skriinimise meetodid, otsene elektroforeetiline uuring (deletsioonide, insertsioonide jne tuvastamine) või integreerimine ekspressioonisüsteemi, et saada valguprodukt ja selle otsene analüüs. .

See meetod on eriti efektiivne "kärbitud" valgu sünteesini viivate mutatsioonide (nonsenssmutatsioonid, splaissimismutatsioonid, suured deletsioonid) tuvastamiseks – nn PTT analüüs (Protein Truncation Test). PTT-analüüsi kasutatakse tavaliselt laiendatud mitme eksoni geenide, näiteks Duchenne'i/Beckeri lihasdüstroofia, ataksia-telangiektaasia või 1. tüüpi neurofibromatoosi geeni uurimisel.

reaalajas PCR(Reaalajas PCR)

Igal aastal muutub reaalajas PCR praktilises tervishoius üha populaarsemaks diagnostikameetodiks. Selle põhiomaduseks on polümeraasi ahelreaktsiooni produktide akumuleerumise jälgimine ja kvantitatiivne analüüs ning tulemuste automaatne registreerimine ja tõlgendamine. See meetod ei nõua elektroforeesi etappi, mis vähendab PCR-laborile esitatavaid nõudeid. Tänu tootmispinna kokkuhoiule, töötajate arvu vähenemisele ja nõudlusele DNA/RNA kvantifitseerimise järele on seda meetodit viimastel aastatel edukalt kasutatud maailma arenenud riikide suurimates sanitaar-epideemia-, diagnostika- ja uurimiskeskustes, asendades PCR-i selle praeguses ("klassikalises") vormingus.

Reaalajas PCR kasutab DNA tuvastamiseks amplifikatsiooni ajal fluorestseeruvalt märgistatud oligonukleotiidsonde. Reaalajas PCR võimaldab proovi täielikku analüüsi 20-60 minuti jooksul ja on teoreetiliselt võimeline tuvastama proovis isegi üksiku DNA või RNA molekuli.

Riis. 17. PCR reaalajas.

Reaalajas PCR kasutab TaqMani süsteemi, et juhtida PCR-i kineetikat otse amplifikatsiooni ajal, kasutadest. Tuvastamiseks kasutatakse sondi, mis kannab fluorofoori ja amplifitseeritud fragmendi keskosaga komplementaarset kustutajat. Kui fluorofoor ja kustutaja on seotud oligonukleotiidsondiga, täheldatakse vaid väikest fluorestseeruvat emissiooni. Tänu Taq polümeraasi 5'-eksonukleaasi aktiivsusele läheb fluorestseeruv märgis amplifikatsiooniprotsessi käigus lahusesse, vabanedes kustutaja lähedusest ja genereerib fluorestsentssignaali, mis suureneb reaalajas võrdeliselt akumuleerumisega. võimendada (joon. 17).

PCR-Real-Time peamised eelised geelelektroforeesiga PCR-i ees:

Kogu meetod toimub ühes katseklaasis;

· Meetod võtab aega 1 tund;

Piisavalt 1-2 tööruumi;

Koos tulemuse kvalitatiivse hindamisega saab võimalikuks selle kvantifitseerimine (näiteks AIDSi või viirushepatiidi viirusevastase ravi määramisel on vaja teada viiruskoormust ehk viiruse kogust 1 ühiku kohta, mis annab reaalse -aeg PCR);

· Vähendab märkimisväärselt saastumise ohtu.

Järeldus

PCR-meetod on üks levinumaid molekulaarbioloogiliste uuringute meetodeid. Arstid peaksid seda meetodit otstarbekalt kasutama ning arstil, kes otsustab oma töös kasutada PCR-i, peab olema teatud teadmised selle meetodi omaduste ja võimaluste kohta. Teiseks peab kliiniku ja PCR labori vahel olema tihe tagasiside, mis on vajalik keeruliste juhtumite analüüsiks ja õige diagnostikastrateegia väljatöötamiseks. Kolmandaks, PCR-analüüs ei ole imerohi diagnoosimisel (eeskätt nakkushaiguste puhul) ega asenda olemasolevaid uurimismeetodeid, vaid ainult täiendab neid. Ja mis kõige tähtsam, PCR ei saa asendada intuitsiooni ja analüütilist mõtlemist, mis edu ootaval arstil olema peaks.

P . S . Molekulaarbioloogilised uuringud - diagnostika ja ravi võrdluspunktide muutmine. Molekulaarbioloogiliste meetodite kasutamine on seotud laboridiagnostika rõhuasetuse radikaalse muutuse väljavaatega. Me ei saa rääkida mitte ainult õigeaegsest teabest, vaid ka selle eelnevast kättesaamisest. Kui praegu tehakse laboratoorseid uuringuid enamikul juhtudel juba kaugelearenenud haigusega ja alustatakse ravi, siis molekulaarbioloogilise laboriinformatsiooniga loodetakse tuvastada inimese kalduvust teatud tüüpi patoloogiatele ja tundlikkust teatud ravimite suhtes, võimaldab põhjendada tulevikumeditsiini ennustavat, ennetavat ja personaliseeritud iseloomu.

DIAGNOOSI JA RAVI FOOKUSE MUUTMINE

PÄRILIKUD HAIGUSED

Täna Tulevikus

Diagnoos Geneetiline pass

8. Mitu tööruumi on vaja fluorestsentstuvastusega (kvantitatiivne analüüs, Real-Time PCR) PCR labori jaoks?

9. Mis on tuvastamine?

10. Milliseid DNA diagnostika meetodeid eristatakse?

11. Milline ensüüm töötab PCR alusel?

12. Miks on vaja tuvastamistsooni teistest töötsoonidest eraldada?

13. Mis on piirangusait?

14. Mis vahe on DNA diagnostika otsesel ja kaudsel meetodil?

15. Mis on järjestamine?

16. Mis on multipleksne PCR?

17. Mis tüüpi mutatsioonid määratakse PCR abil?

18. Mis on saastumine?

19. Mis on alleelispetsiifilise amplifikatsioonimeetodi olemus?

20. PCR materjali säilitustingimused?

21. Millist seadet kasutatakse võimendamiseks?

22. Mis on pöördtranskriptaasi PCR (RT-PCR) meetod?

23. Mis on PCR diagnostika materjal?

24. Loetlege saastetüübid?

Testid iseõppimiseks

1. Restriktsiooni endonukleaasid:

a) ensüümid, mis “murdavad” DNA-d rangelt kindlates kohtades;

b) ensüümid, mis õmblevad DNA molekulis katkeid;

c) ensüümid, mis annavad ühendeid, mis teostavad DNA parandamist.

2. Geeni võimendamine:

3. Millist molekulaargeneetika meetoditest kasutatakse teadaoleva järjestusega mutantse geeni põhjustatud haiguste diagnoosimiseks?

a) konkreetse piirangu kasutamine;

b) otsene tuvastamine, kasutades spetsiifilisi molekulaarsonde;

c) normaalse restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismi jaotuse perekondlik analüüs.

4. DNA sekveneerimine:

a) DNA alusjärjestuse tuvastamine;

b) mis tahes DNA segmendi korduv kordamine;

c) uuritavat geeni sisaldava DNA fragmendi eraldamine.

5. DNA proove saab hankida kasutades :

b) koorioni villid;

c) lootevesi;

d) lootevee rakud;

e) naha, lihaste, maksa biopsiad,

e) kõik on õige, välja arvatud punkt "c",

g) kõik on õige, välja arvatud punkt "d",

h) Kõik ülaltoodud on õiged.

6. Milliseid mutatsioone diagnoositakse PCR abil?

a) genoomne;

b) kromosomaalne;

c) geen (punkt).

7. Praimer on:

a) DNA komplementaarne osa;

b) sünteetiline oligonukleotiidiga märgistatud (radioaktiivselt või fluorestseeruvalt) järjestus, mis on komplementaarne mutantse või normaalse geeniga;

c) oligonukleotiid, mis toimib "seemnena" ja initsieerib polünukleotiidahela sünteesi DNA või RNA matriitsil.

8. Kes töötas välja PCR-meetodi põhimõtte?

b) K. Mullis

9. Kas trinukleotiidi korduste (dünaamilise tüüpi mutatsioonide) laienemise diagnoosimiseks kasutatakse PCR-meetodit?

10. Millistes valdkondades kasutatakse PCR-i?

a) kliiniline meditsiin;

b) transgeensete organismide (GMO) määratlus

c) isiku tuvastamine, isaduse tuvastamine, kriminalistika

d) kõik ülaltoodud

d) mitte ükski ülaltoodust.

Vastuste näidised: 1 - a; 2 - b; 3 - b; 4 - a; 5 - e; 6 - sisse; 7 - sisse; 8 - b; 9 – a, 10 – d.

Peamine

1. Bochkovi geneetika. Moskva. GEOTAR, 2002.

Lisaks

1., Bakharev ja laste kaasasündinud ja pärilike haiguste ravi. - Moskva, 2004.

2. DNA diagnostika ja meditsiinigeneetiline nõustamine. - Moskva, 2004.

3. Gintergeneetika. - Moskva, 2003.

4. Gorbunov meditsiinigeneetika alused. - Peterburi: Intermedica, 1999.

5. Herrington S., J. McGee. Molekulaarne kliiniline diagnostika. – Maailm, 1999.

6. Menšikov - bioloogilised uuringud kliinilises laboratoorses diagnostikas: probleemi võimalused (loengud). Kliiniline laboridiagnostika, nr 3, 2006.

7. Kornienko PCR labori tööst bioloogilise materjali in-line analüüsi käigus. Kliiniline laboratoorne diagnostika, nr 10, 2006.

8. PCR labori töö korraldus. Metoodilised juhised. MU 1.3.1794-03. Vene Föderatsiooni peasanitararst, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnoloogia. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Reaalajas kvantitatiivne PCR. Genome Res. - nr 6, 1996.

MEETODI PEAMISED PÕHIMÕTTED

POLÜMERAASI KETREAKTSIOON

Üldmeditsiini (060101) ja pediaatria (060103) erialade 3-4 kursuse üliõpilaste õppekavavälise töö metoodiline juhend.

SEI HPE "Föderaalse Tervise- ja Sotsiaalarengu Agentuuri Krasnojarski Riiklik Meditsiiniakadeemia"

Venemaa, Krasnojarsk,

Paljude nakkushaiguste piisavaks ja tõhusaks raviks on vaja õigeaegselt määrata täpne diagnoos. Selle probleemi lahendamisel on tänapäeval kaasatud kõrgtehnoloogilised molekulaarbioloogia meetoditel põhinevad diagnostikameetodid. Praegu kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) juba laialdaselt praktilises meditsiinis kui kõige usaldusväärsemat laboratoorset diagnostikavahendit.

Mis seletab PCR-i populaarsust praegusel ajal?

Esiteks kasutatakse seda meetodit erinevate nakkushaiguste patogeenide suure täpsusega tuvastamiseks.

Teiseks jälgida ravi efektiivsust.

Erinevates käsiraamatutes, prospektides, artiklites, aga ka eriarstide selgitustes kohtame sageli arusaamatute terminite ja sõnade kasutamist. Kõrgtehnoloogilistest teaduse toodetest on tõesti raske tavaliste sõnadega rääkida.

Mis on PCR-diagnostika olemus ja mehaanika?

Igal elusorganismil on oma ainulaadsed geenid. Geenid asuvad DNA molekulis, mis on tegelikult iga konkreetse organismi "visiitkaart". DNA (geneetiline materjal) on väga pikk molekul, mis koosneb ehitusplokkidest, mida nimetatakse nukleotiidideks. Iga nakkushaiguste patogeeni jaoks paiknevad need rangelt spetsiifiliselt, st teatud järjestuses ja kombinatsioonis. Kui on vaja aru saada, kas inimesel on konkreetne haigusetekitaja, võetakse bioloogiline materjal (veri, uriin, sülg, määrdumine), mis sisaldab mikroobi DNA-d või DNA fragmente. Kuid patogeeni geneetilise materjali hulk on väga väike ja on võimatu öelda, millisesse mikroorganismisse see kuulub. Selle probleemi lahendamiseks kasutatakse PCR-i. Polümeraasi ahelreaktsiooni olemus seisneb selles, et uurimiseks võetakse vähe DNA-d sisaldavat materjali ning PCR protsessi käigus suureneb konkreetsele patogeenile kuuluva geneetilise materjali hulk ning seeläbi on võimalik seda tuvastada.

PCR diagnostika on biomaterjali geneetiline uuring.

PCR-meetodi idee kuulub Ameerika teadlasele K. Mullinsile, mille ta pakkus välja 1983. aastal. Laialdast kliinilist kasutamist sai see aga alles XX sajandi 90ndate keskel.

Tegeleme terminoloogiaga, mis see on - DNA jne. Iga elusolendi (loom, taim, inimene, bakter, viirus) rakul on kromosoomid. Kromosoomid on geneetilise teabe hoidjad, mis sisaldavad iga konkreetse elusolendi kogu geenide järjestust.

Iga kromosoom koosneb kahest DNA ahelast, mis on üksteise suhtes keerdunud spiraaliks. DNA on keemiliselt desoksüribonukleiinhape, mis koosneb struktuurikomponentidest – nukleotiididest. Nukleotiide on 5 tüüpi – tümiin (T), adenosiin (A), guaniin (G), tsütosiin (C) ja uratsiil (U). Nukleotiidid paiknevad üksteise järel ranges individuaalses järjestuses, moodustades geene. Üks geen võib koosneda 20-200 sellisest nukleotiidist. Näiteks insuliini tootmist kodeeriv geen on 60 aluspaari pikkune.

Nukleotiididel on komplementaarsuse omadus. See tähendab, et DNA ühes ahelas on vastassuunaline adeniin (A) alati teises ahelas tümiin (T) ja guaniin (G) vastas - tsütosiin (C). Skemaatiliselt näeb välja selline:
G-C
T-A
A-T
See komplementaarsuse omadus on PCR jaoks võtmetähtsusega.

Lisaks DNA-le on RNA-l sama struktuur – ribonukleiinhape, mis erineb DNA-st selle poolest, et kasutab tümiini asemel uratsiili. RNA - on geneetilise teabe hoidja mõnedes viirustes, mida nimetatakse retroviirusteks (näiteks HIV).

DNA ja RNA molekulid võivad "paljuneda" (seda omadust kasutatakse PCR jaoks). See toimub järgmiselt: kaks DNA või RNA ahelat eemalduvad teineteisest külgedele, igal niidil istub spetsiaalne ensüüm, mis sünteesib uue ahela. Süntees toimub komplementaarsuse põhimõttel, see tähendab, et kui nukleotiid A on algses DNA ahelas, siis T on äsja sünteesitud ahelas, kui G - siis C jne. See eriline "ehitaja" ensüüm vajab sünteesi alustamiseks "seemnet" - 5-15 nukleotiidist koosnevat järjestust. See "seeme" on määratletud iga geeni jaoks (klamüüdia geen, mükoplasma, viirused) katseliselt.

Seega koosneb iga PCR-tsükkel kolmest etapist. Esimeses etapis toimub DNA nn lahtikerimine – see tähendab kahe omavahel ühendatud DNA ahela eraldumine. Teises on "seeme" kinnitatud DNA ahela osa külge. Ja lõpuks nende DNA ahelate pikenemine, mida toodab "ehitaja" ensüüm. Praegu toimub kogu see keeruline protsess ühes katseklaasis ja koosneb korduvatest DNA reprodutseerimise tsüklitest, mida määratakse, et saada suur hulk koopiaid, mida saab seejärel tuvastada tavapäraste meetoditega. See tähendab, et ühest DNA ahelast saame sadu või tuhandeid.

PCR-uuringu etapid

Bioloogilise materjali kogumine uurimistööks

Prooviks on mitmesugused bioloogilised materjalid: veri ja selle komponendid, uriin, sülg, limaskestade eritised, tserebrospinaalvedelik, eritis haavapindadest, kehaõõnsuste sisu. Kõik bioproovid kogutakse ühekordselt kasutatavate instrumentidega ja kogutud materjal asetatakse steriilsetesse plasttorudesse või asetatakse söötmele, millele järgneb transport laborisse.

Võetud proovidele lisatakse vajalikud reaktiivid ja asetatakse programmeeritavasse termostaati - termotsüklerisse (võimendisse). Tsükleris korratakse PCR-i tsüklit 30-50 korda, mis koosneb kolmest etapist (denatureerimine, lõõmutamine ja elongatsioon). Mida see tähendab? Vaatleme üksikasjalikumalt.

Vahetu PCR reaktsiooni etapid, geneetilise materjali kopeerimine

maPCR etapp – geneetilise materjali ettevalmistamine kopeerimiseks.
Tekib temperatuuril 95 ° C, samal ajal kui DNA ahelad on lahti ühendatud ja "seemned" võivad neile istuda.

"Seemneid" toodavad tööstuslikult erinevad teadus- ja tootmisühingud ning laborid ostavad valmis. Samas näiteks klamüüdia tuvastamise “seeme” töötab ainult klamüüdia jne puhul. Seega, kui biomaterjali testitakse klamüüdiainfektsiooni esinemise suhtes, asetatakse reaktsioonisegusse klamüüdia "seeme"; kui testitakse biomaterjali Epstein-Barri viiruse suhtes, siis Epstein-Barri viiruse "seeme".

IIetapp – nakkustekitaja ja "seemne" geneetilise materjali kombineerimine.
Kui on vaja määrata viiruse või bakteri DNA-d, asub "seeme" sellel DNA-l. See praimeri lisamise protsess on PCR-i teine ​​etapp. See etapp toimub temperatuuril 75 °C.

IIIetapp – nakkustekitaja geneetilise materjali kopeerimine.
See on geneetilise materjali tegelik pikenemise või paljunemise protsess, mis toimub 72 °C juures. Ensüümiehitaja läheneb "seemnetele" ja sünteesib uue DNA ahela. Uue DNA ahela sünteesi lõppedes lõpeb ka PCR tsükkel. See tähendab, et ühes PCR-tsüklis kahekordistub geneetilise materjali hulk. Näiteks esialgses proovis oli 100 viiruse DNA molekuli, pärast esimest PCR tsüklit on proovis juba 200 testitava viiruse DNA molekuli. Üks tsükkel kestab 2-3 minutit.

Selleks, et genereerida identifitseerimiseks piisavalt geneetilist materjali, tehakse tavaliselt 30-50 PCR tsüklit, mis võtab aega 2-3 tundi.

Paljundatud geneetilise materjali tuvastamise etapp

PCR ise lõpeb siin ja siis tuleb sama oluline identifitseerimise etapp. Identifitseerimiseks kasutatakse elektroforeesi või märgistatud "seemneid". Elektroforeesi kasutamisel eraldatakse saadud DNA ahelad suuruse järgi ja erineva pikkusega DNA fragmentide olemasolu näitab analüüsi positiivset tulemust (see tähendab konkreetse viiruse, bakteri jne olemasolu). Märgistatud "seemnete" kasutamisel lisatakse reaktsiooni lõpp-produktile kromogeen (värv), mille tulemusena kaasneb ensümaatilise reaktsiooniga värvuse teke. Värvuse tekkimine näitab otseselt, et algproovis on viirus või mõni muu tuvastatav aine.

Tänaseks on võimalik märgistatud "seemneid" ja ka vastavat tarkvara kasutades PCR tulemusi kohe "lugeda". See on nn reaalajas PCR.

Miks on PCR-diagnostika nii väärtuslik?

PCR-meetodi üks olulisi eeliseid on selle kõrge tundlikkus - 95-100%. Need eelised peavad aga põhinema järgmiste tingimuste vältimatul järgimisel:

1. õige proovide võtmine, bioloogilise materjali transport;
2. steriilsete, ühekordselt kasutatavate instrumentide, spetsiaalsete laborite ja koolitatud personali kättesaadavus;
3. metoodika ja steriilsuse range järgimine analüüsi ajal

Tundlikkus on erinevate tuvastatud mikroobide puhul erinev. Nii näiteks on C-hepatiidi viiruse tuvastamise PCR-meetodi tundlikkus 97–98%, ureaplasma tuvastamise tundlikkus on 99–100%.

PCR analüüsile omased võimalused võimaldavad teil saavutada ületamatu analüütilise spetsiifilisuse. See tähendab, et tuvastatakse täpselt see mikroorganism, mida otsiti, mitte aga sarnane või lähedalt seotud.
PCR-meetodi diagnostiline tundlikkus ja spetsiifilisus ületab sageli kultiveerimismeetodi omad, mida nimetatakse nakkushaiguste tuvastamise "kuldstandardiks". Arvestades kultuuri kasvu kestust (mitu päeva kuni mitu nädalat), ilmneb PCR-meetodi eelis.

PCR infektsioonide diagnoosimisel
PCR-meetodi eelised (tundlikkus ja spetsiifilisus) määravad tänapäeva meditsiinis laia kasutusala.
PCR-diagnostika peamised rakendusvaldkonnad:

1. erineva lokaliseerimisega ägedate ja krooniliste nakkushaiguste diagnoosimine
2. ravi efektiivsuse jälgimine
3. patogeeni tüübi selgitamine

PCR-i kasutatakse sünnitusabis, günekoloogias, neonatoloogias, pediaatrias, uroloogias, venereoloogias, nefroloogias, nakkushaiguste kliinikus, oftalmoloogias, neuroloogias, ftisiopulmonoloogias jne.

PCR-diagnostika kasutamine toimub koos teiste uurimismeetoditega (ELISA, PIF, RIF jne). Nende kombinatsiooni ja otstarbekuse määrab raviarst.

PCR-iga tuvastatud nakkusetekitajad

Viirused:

1. HIV-1 ja HIV-2 retroviirused
2. herpetiformsed viirused
3. 1. ja 2. tüüpi herpes simplex viirus

Artikli sisu:

Väga informatiivne PCR meetod (polümeraasi ahelreaktsioon) võimaldab varakult avastada erinevaid geneetilisi ja nakkushaigusi, mis esinevad ägedalt või krooniliselt. Pealegi saab neid tuvastada isegi siis, kui neil pole mingeid sümptomeid. Kõige sagedamini kasutatakse PCR-analüüsi sugulisel teel levivate infektsioonide (STD-d, STI-d) tuvastamiseks.

PCR-analüüs viitab molekulaardiagnostika meetodile, mis põhineb patogeeni nukleiinhappe (DNA) teatud fragmentide väikeste kontsentratsioonide mitmekordsel suurendamisel mis tahes bioloogilises materjalis (emakakaela, tupe, ureetra, vere, sülje, röga jne) ja võrrelda selle DNA-d või RNA-d teadaolevate nakkusetekitajate liikide andmebaasiga.

Tehnika töötas välja ameeriklane Carrie Mullis eelmise sajandi 80ndatel. 1993. aastal võitis teadlane Nobeli keemiapreemia. Tänapäeval peetakse PCR-uuringut omamoodi "kuldstandardiks" enamiku infektsioonide diagnoosimisel. PCR-analüüsi kasutatakse meditsiinipraktikas laialdaselt haiguse olemuse selgitamiseks ja täpse diagnoosi tegemiseks. Väga sageli on juhtumeid, kui kõik teadaolevad immunoloogilised, viroloogilised ja bakterioloogilised meetodid ei tööta. Siis on PCR ainus viis haiguse aktiivse staadiumi tuvastamiseks.

PCR-diagnostika eelised teiste meetodite ees

PCR-tehnika on leidnud laialdast rakendust kaasaegses meditsiinis mitmete vaieldamatute eeliste tõttu. Räägime neist üksikasjalikumalt.

Võimalus otseselt tuvastada patogeeni olemasolu

Paljud traditsioonilised diagnostikameetodid põhinevad markerite – valkude, mis on patogeeni jääkproduktid – määramisel. Selline diagnostiline põhimõte võib anda ainult kaudset kinnitust patoloogia kohta. PCR-meetod võimaldab patogeeni otseselt tuvastada, kuna see tuvastab patogeensete organismide DNA spetsiifilised lõigud.

Kõrge spetsiifilisus

PCR-meetod on väga spetsiifiline, kuna see võimaldab tuvastada DNA fragmente, mis on iseloomulikud ainult konkreetsele nakkustekitajale. Immunoloogiliste meetodite kasutamisel on võimalus saada vale tulemus (diagnoosimise vead on seotud ristreageerivate antigeenidega). Mis puutub PCR-i, siis siin on vead välistatud, kuna spetsiifilisuse määrab sel juhul praimerite nukleotiidjärjestus.

Kõrge tundlikkus

Selle meetodi abil määratakse isegi üksikud patogeenid. Inimorganismis tuvastatakse nakkustekitajad ka siis, kui muud diagnostilised meetodid olukorda ei selgita (jutt on erinevatest immunoloogilistest mikroskoopilistest ja bakterioloogilistest uurimismeetoditest).

Võrdluseks esitame andmed. Mikroskoopiliste ja immunoloogiliste meetodite tundlikkus on 103-105 rakku ja PCR tundlikkus 10-100 rakku proovi kohta.

Meetodi universaalsus

PCR tehnika põhineb patogeensete organismide DNA uurimisel. Uuringu käigus määratakse RNA või DNA fragmendid, mis on spetsiifilised konkreetsete nakkusetekitajate suhtes. Kuna kõik nukleiinhapped on sarnase keemilise koostisega, saab laborianalüüsis kasutada standardseid protseduure. See tähendab, et ühe proovi uurimine võimaldab tuvastada mitu patogeeni korraga.

Kiired tulemused

See meetod ei nõua patogeenide kultuuride kasvatamist, mis võtab üsna palju aega. Tänu ühtse tehnoloogia kasutamisele materjali töötlemisel ja reaktsiooniproduktide tuvastamisel ning automatiseeritud võimendusprotsessile võtab kogu uurimisprotseduur aega vaid mõne tunni.

Võimalus tuvastada varjatud nakkusi

PCR tehnika võimaldab efektiivselt teostada prekliinilist diagnostikat (patogeenide avastamine enne sümptomite tekkimist) ja retrospektiivset diagnostikat (patogeenide määramine pärast haigust). Seega on prekliinilisel diagnostikal suur tähtsus patsiendi uurimisel võimaliku haiguse inkubatsiooniperioodil - pärast väidetavat nakatumist enne esimeste märkide ilmnemist.

PCR-i üheks oluliseks eeliseks on võimalus kasutada analüüsimiseks bioloogilisi jääke või arhiivimaterjale. See võimaldab tuvastada isadust ja isiksust.

Praeguseks on PCR-diagnostika meetodid jätkuvalt arenenud. Analüüsitehnoloogiat ennast täiustatakse ja esile kerkib ka uut tüüpi PCR. Selle reaktsiooni uuenduslikud testimissüsteemid võetakse meditsiinipraktikasse. Tänu sellele teaduse kiirele arengule protseduuri maksumus väheneb ja nüüd saab PCR-uuringut rakendada paljudele patsientide kategooriatele.

See diagnostiline meetod põhineb antud RNA või DNA lõigu mitmekordsel kahekordistamisel. See protsess viiakse läbi laboris spetsiaalsete ensüümide abil. Selle tulemusena moodustub nii palju DNA (RNA) sektsioone, kui on vaja visuaalseks uurimiseks. Protseduuri käigus kopeeritakse ainult kindlaksmääratud tingimustele vastav ala (kui see on uuritavas proovis olemas).

Bioloogiline materjal, mida tuleb uurida patogeenide DNA või RNA olemasolu suhtes, asetatakse võimendisse. (Sõltuvalt konkreetsest olukorrast võetakse analüüsimiseks verd, uriini, sülge, genitaalidest eritunud). Seejärel lisatakse proovidele spetsiaalseid ensüüme. Nad seonduvad patogeensete mikroobide RNA või DNA-ga ja algab koopiate süntees. Kopeerimine on mitmeetapiline protsess, mis kulgeb nagu ahelreaktsioon. Selle tulemusena võib ilmuda sadu või isegi tuhandeid koopiaid.

Diagnostika järgmises etapis analüüsitakse tulemusi ja võrreldakse neid nakkusetekitajate andmebaasiga.

PCR-tehnika ei võimalda mitte ainult määrata patogeense organismi tüüpi, vaid ka teha järeldusi nakkusetekitajate arvu kohta inimkehas.
Tänapäeval avab selliste tehnoloogiate kasutamine laialdased võimalused mutatsioonide, DNA lõikude splaissimise uurimisel. Kaasaegses meditsiinis hakati seda meetodit kasutama isaduse määramiseks, uute geenide tuvastamiseks ja paljuks muuks.

Tänu oma mitmekülgsusele on PCR meetod leidnud laialdast rakendust uroloogias, günekoloogias, pulmonoloogias, onkoloogias, hematoloogias, ftisioloogias, nakkushaiguste praktikas ja teistes meditsiinivaldkondades.

Materjal PCR analüüsiks

PCR diagnostikaks kasutatakse erinevaid inimkehast võetud bioloogilisi keskkondi ja vedelikke: röga, lima, sülge, uriini, verd, epiteelirakkude kraapimist, platsenta kudesid, pleura vedelikku, lootevett, eesnäärme mahla jne.

STD-de (STI) diagnoosimisel analüüsitakse eritumist meeste ja naiste suguelunditest. Selleks tehke kusiti või emakakaela määrdumine või kraapimine. Uurimiseks kasutatakse ka uriini.

Infektsioonide (herpes, mononukleoos, CMVI, toksoplasmoos, HIV, B- ja C-hepatiit) tuvastamiseks võetakse analüüsiks verd. Närvisüsteemi kahjustuse kahtluse korral võetakse tserebrospinaalvedelikku.

Pulmonoloogiliste uuringute jaoks kasutatakse pleura vedelikku ja röga.

Emakasiseste infektsioonide tuvastamiseks analüüsitakse platsenta kudesid ja lootevett.

PCR STI-de ja muude infektsioonide jaoks

Milliseid infektsioone saab PCR-analüüsiga tuvastada

HIV-nakkus (saab tuvastada inimese immuunpuudulikkuse viiruse HIV-1).

Viiruslik hepatiit A, B, C, G (RNA-HAV, DNA-HBV, RNA-HCV, RNA-HGV).

STI-d (sugulisel teel levivad infektsioonid) - ureaplasmoos, gardnerelloos, klamüüdia, mükoplasmoos, trikhomoniaas.

Nakkuslik mononukleoos (Epstein-Barri viiruse DNA - EBV).

Tsütomegaloviiruse infektsioon (DNA-CMV).

Herpeetiline infektsioon (DNA - herpes simplex viiruse HSV tüübid 1 ja 2).

Tuberkuloos (mycobacterium tuberculosis).

Onkogeensed viirused - papilloomiviiruse infektsioon (inimese papilloomiviirus (sh selle onkogeensed liigid 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 ja 59).

Borrelioos, puukentsefaliit.

Listerioos.

Candidiasis (perekonna Candida seened).

Helicobacter pylori infektsioon
ja teised.

PCR analüüsi koostamine ja esitamine

Patsiendid, kes esitasid materjali PCR diagnostika jaoks, loodavad saada kiiret ja täpset tulemust. Samal ajal tuleks arvestada ühe olulise punktiga - diagnostika usaldusväärsus ei sõltu ainult spetsialistide professionaalsusest ja meditsiinilabori võimalustest. Selleks, et uuring oleks informatiivne, peab patsient ise pingutama. Seega on vaja rangelt järgida kõiki arsti soovitusi ja hoolikalt järgida materjali kogumise ettevalmistamise reegleid. Väga oluline on vältida bioloogiliste proovide saastumist, vastasel juhul moonutatakse uuringu tulemusi.

Ettevalmistus PCR analüüsiks

Protseduuri ettevalmistamine ei ole seotud eriliste raskustega. Pidage meeles mõnda reeglit:

PCR analüüsi jaoks võetakse veri tühja kõhuga. Veri võetakse veenist tavaliselt hommikul steriilse nõelaga spetsiaalsesse anumasse.

Päeva jooksul enne materjali proovi võtmist ilmneb sugulisel teel levivate infektsioonide PCR-määrimisel seksuaalne abstinents.

PCR-i uriinianalüüsiks võetakse esimene portsjon, konteiner peab olema steriilne.

Kuidas teha PCR analüüsi meestel ja naistel

Meestelt ja naistelt võetakse vaktsineerimisruumis PCR analüüs, see on veeniveri, sülg, neelust võetud tampoonid, mandlid, tampoonid ninaneelust jne. Kogumismeetod ei erine.

STI-de PCR tehakse sünnieelses kliinikus naiste günekoloogilise läbivaatuse käigus, need on tupest, emakakaela ja kusiti määrdumised. Meestel on androloogi või venereoloogi visiidi ajal tegemist ureetra määrimisega.

PCR-i materjali proovivõtu skeemid

Kui kaua PCR aega võtab

Patsiendid ei pea PCR-uuringu tulemusi kaua ootama. Kogu analüüsiprotseduur kestab tavaliselt mitmest tunnist (reaalajas PCR) kuni 2-10 päevani. Analüüsi tulemused saab patsient reeglina 2-5 päeva jooksul, maksimaalselt 10 päeva pärast, see oleneb analüüsi tüübist. Pikim aeg on PCR verediagnostika HIV ja hepatiidi korral ning lühem määrdumine ja kraapimine - 2-3 päeva.

Negatiivne tulemus näitab, et hetkel ei tuvastata bioloogilises materjalis nakkusetekitajate jälgi. See tähendab, et infektsioon, mille suhtes uuring läbi viidi, puudub.

Positiivne tulemus näitab patogeeni jälgede tuvastamist bioloogilistes proovides. See tähendab, et sel ajal on inimkehas infektsioon.
Võib juhtuda, et PCR annab positiivse tulemuse, kuid aktiivset nakkusprotsessi ei täheldata. Seda nähtust nimetatakse "tervislikuks veoks". Sellise patsiendi ravi ei ole vajalik, kuid ta peab olema pideva dünaamilise järelevalve all. Sellised olukorrad on tüüpilised viirusnakkustele: Epstein-Barri viirus (EBV), genitaalherpes, tsütomegaloviirusnakkus (CMVI), inimese papilloomiviirus (HPV), mille puhul võetakse proove uurimiseks lokaalsetest koldest (ureetra, emakakaela kanali kraapimine, sülg). Samas ei tohi unustada, et terve kandja võib nakkuse teistele inimestele edasi anda. Lisaks ei ole välistatud nakkusprotsessi aktiveerimine. Juhtudel, kui PCR annab vereanalüüsis positiivse tulemuse, ei saa seda enam pidada kandjaks. Sellised patsiendid vajavad tuvastatud patogeeni põhjustatud haiguse spetsiifilist ravi.

Kvantitatiivsetel näitajatel ei ole üldisi gradatsioone. Arst hindab neid iga konkreetse infektsiooni puhul eraldi. Kvantitatiivne tulemus võimaldab kindlaks teha, kui aktiivne on nakkus ja tuvastada protsessi etapp.

PCR-meetodi usaldusväärsus

Metoodika tõhususe hindamiseks on kolm kriteeriumi:

- Täpsus- nakkuse (või selle puudumise) avastamine suure tõenäosusega.

- Spetsiifilisus– konkreetse patogeeni määramise täpsus.

- Tundlikkus– patogeeni tuvastamise võimalus isegi väikese koguse geneetilise materjaliga bioloogilistes proovides.

PCR-meetodi kasutamisel on valepositiivsete tulemuste saamine peaaegu võimatu (st kui patogeen puudub, siis positiivset proovi ei tule).

Valenegatiivne tulemus on võimalik, kuid seda juhtub üsna harva. Sarnased olukorrad tekivad siis, kui infektsioon on uuringu ajal passiivne. Näiteks krooniline infektsioon ilma aktiivsuseta või varjatud infektsioon.

PCR analüüs: video