Купить саженцы различных культур для садоводов сейчас не составляет никакого труда. Их можно заказать в Интернете и увидеть на местных рынках. Ассортимент и диапазон цен очень широк, например, саженцы малины и ежевики можно найти по 5-7 грн, клубнику – по 2 грн, а за супер - новинки придется выложить несколько сотен гривен. Думаю, многие садоводы, заказывая посадочный материал, оставались не довольными их качеством. Чтобы конкурировать и снизить цену на саженцы производители не редко упрощают технологию, которую необходимо выдерживать на маточниках. В результате саженцы получаются слабые и болезненные.
Но садоводам и фермерам нужен качественный и здоровый посадочный материал за приемлемую цену. Выходом из ситуации может стать микроклональное размножение растений (in vitro , дословно в стекле) – новая технология вегетативного размножения растений, позволяющая в ограниченные сроки получить большое количество идентичных копий (клонов) исходного растения. Кроме непосредственно размножения, технология дает возможность избавиться от подавляющего большинства инфекций (вирусов, бактерий, грибов и т.д.), при условии соблюдения технологических приемов. За счет этого, растения после in vitro размножения обладают значительно лучшими характеристиками (сила роста, продуктивность, устойчивость к болезням и т.д.) по сравнению с исходными растениями. Такой посадочный материал относят к разряду супер-супер элиты.
Ответить на наши вопросы на тему «in vitro» любезно согласился Алексей Викторович - кандидат сельскохозяйственных наук с опытом работы с культурой тканей растений (микроклональное размножение).
«Biznesselo»: Алексей Викторович, расскажите какие растения можно размножать ин-витро?
Во-первых, начнем с того, что немного развеем мифы и заблуждения. Технология микроклонального размножения растений (англ., in vitro microclonal plant propagation) – очень старый и широко используемый во все цивилизованном мире метод быстрого размножения растительного материала. Первые протоколы сред для размножения были описаны физиологами растений Тошио Мурасиге и Фольке К. Скугом еще в далеком 1962 году. В настоящее время практически весь посадочный материал заграницей получают при использовании в той или иной мере метода in vitro.
Во-вторых, по своей сути ничего особо мистического и загадочного в методе нет, за исключением самого громкого названия. Это просто еще один хорошо модифицированный способ обычного вегетативного размножения, который позволяет в ограниченное время получить свободный от патогенов посадочный материал в больших или очень больших количествах.
Лаконично отвечая на Ваш вопрос – любые, с определенными ограничениями, связанными с особенностями роста тех или иных растений. Как правило, чем лучше растения размножаются в природе, тем выше будет коэффициент размножения и в культуре in vitro.
«Biznesselo»: Какие основные этапы микроклонального размножения?
● введение в асептическую культуру (стерильные условия);
● непосредственно размножение;
● адаптация (выведение из культуры in vitro) растений к условиям in vivo (обычным)
«Biznesselo»: Расскажите подробнее, как удается избавляться от бактерий, грибов и главное вирусов?
Во-первых, для введения в культуру in vitro используют точки роста растений, условно говоря, внутреннюю часть почки (апикальные меристемы), которые само растения защищает от патогенов. Во-вторых, на начальном этапе части растений (экспланты) обрабатывают веществами убивающие большинство патогенов (соли сулемы, перекись водорода, спирт и т.д.). И, наконец, в-третьих, во время культивирования и пересадки растений удаляются больные и зараженные бактериями и грибами.
Немного сложнее обстоят дела с вирусами. В этом случае или берут заранее здоровые от вирусов растения (проводят диагностику наличия вирусов методами молекулярной биологии, как при заболеваниях человека) или избавляются от вирусов методом термической терапии.
«Biznesselo»: Какая примерно себестоимость саженца in vitro (например, малина, земляника, ежевика) сравнительно с посадочным материалом, который был размножен традиционным способом?
Конечная цена определяется в основном ценами на энергоресурсы, стоимостью реактивов (химические соли и фитогормоны), поскольку растения длительное время “живут” в условиях искусственного освещения на специальных твердых субстратах (агаризированной среде). В среднем, стоимость одного in vitro саженца превышает стоимость обычного в 1,5 – 2 раза. При этом следует учитывать количество размножаемых растений, чем больше оборот, тем меньше себестоимость.
«Biznesselo»: Можно ли применять технологию ин-витро для получения новых сортов и видов растений?
Вопрос очень интересный. Одновременно и простой и сложный. Связано это со сложностью самого определения сорта. Как реально работающий в этой области молекулярный генетик могу однозначно сказать, что описательная морфология как главный критерий при регистрации того или иного сорта растений – это очередная кормушка для нечестных людей. Вы, наверное, удивитесь, но очень многие сорта это результат воровства друг у друга или вывезенные в кармане из-за границы растения, которые проявляют разные морфологические характеристики в других климатических зонах (в пределах фенотипической изменчивости). Любые попытки ввести в госреестр элементы генетического контроля происхождения сортов, на сегодняшний день, обречены по понятным нам всем причинам.
Так вот, культура in vitro позволяет отобрать из большого числа клонов устойчивые к химическим соединениям, абиотическим факторам и т.д. растения. Будут ли эти клоны новыми сортами вопрос скорее юридический, чем биологический.
Другое дело, что как составной элемент целого ряда направлений клеточной биологии, культура in vitro помогает получать новые виды, ранее в природе не существовавшие. Но это уже совсем другой разговор.
«Biznesselo»: Возможны ли мутации при микроклональном размножении?
Теоретически – да. Но как показывает мой опыт, при соблюдении элементарной этики работы доля растений с измененным фенотипом, статистически ничтожна.
«Biznesselo»: Какая приживаемость у in vitro растений?
Все in vitro саженцы – растения с закрытой корневой системой. Приживаемость такого посадочного материала – максимально возможная.
«Biznesselo»: Правда, что растения размножены микроклональным способом, более устойчивы к болезням и неблагоприятным погодным условиям?
Строго говоря, к абиотическим факторам – нет. С другой стороны любая устойчивость имеет полигенный характер, как проявления, так и наследования (работают одновременно много генов и их взаимодействия определяются ответом на конкретные условия, т.е. не всегда линейно и последовательно). Другими словами, если Вы не подкормили на зиму растения и не укрыли незимостойкие, никакие технологии не спасут от вымерзания. Но, если Вы все необходимые процедуры выполнили, то устойчивость оздоровленных растений будет выше. При этом никаких статистически достоверных подтверждений такой устойчивости я привести не могу.
С патогенами ситуация более понятна: однозначно in vitro саженцы имеют конкурентные преимущества по сравнению с обычными. Они изначально здоровы, поэтому развиваются и плодоносят быстрее. А уже взрослые растения (в зависимости от сортовых особенностей конечно) сами могут за себя “постоять”.
«Biznesselo»: Мы планируем заложить маточник малины и земляники. Какой класс растений вы бы посоветовали использовать?
Здоровые и районированные. Как мне кажется, работы по закладке маточника нужно начинать не с растений, а анализа почвы и климатических условий. При этом любые агротехнические приемы способны повышать урожайность. Например, для всех нам известного картофеля, удаление соцветий в стадии бутонизации способно повышать конечный валовый выход продукции до 10 %. То же самое относится и к окучиванию, фумигации, корневым подкормкам и т.д. Я уже не говорю про предварительное выращивание сидератов как способа обогащения почвы и борьбы с сорняками.
Поэтому, для раскрытия генетического потенциала растения нужно создать оптимальные условия. Без серьезной предварительной работы выбор класса саженцов не имеет значения.
Если не знаешь, что выращивать – выращивай орехи. Украинские аграрии, светлые умы, имеющие деньги, и многие другие тяготеют к такой мысли и не потому, что плод грецкого ореха внешне напоминает человеческий мозг. Хотя в Украине никто не знает, сколько площадей занято ореховыми садами, и сложно прогнозировать изменения на внутреннем рынке сбыта, спрос на этот белковый продукт стабильно высок, потребители съедают все произведенные в мире орехи, культура потребления орехов особенно развита в мусульманских странах.
Орехи всегда интересны для производителя – заманчивая стоимость продукта, высокий доход, растут и плодоносят около 100 лет. Одна проблема – найти хорошие саженцы. В Украине таких практически нет. А качественные иностранные саженцы при пересечении границы в воздушной среде, без кома земли, поскольку землю перевозить запрещено, теряют влагу и портятся. Корневая система у ореха уязвима, легко повреждаются ворсинки корешков, а поврежденные корни становятся рассадником патогенной микрофлоры. Отсюда и болезни, и сложности с приживаемостью.
Ореховоды по-разному решают проблему с посадочным материалом, пока украинские ореховые сады не отличаются особой привлекательностью. Вот, говорят в Молдове смогли, их ореховые сады – загляденье. Но охотников делиться секретами мастерства нет. Зачем создавать конкурентов столь прибыльного бизнеса? Несмотря на это, эксперты плодоовощного рынка прогнозируют новый виток развития орехового дела и в Украине, потому что многие хотят и не стоят на месте.
Жизнь из пробирки
Сотни маленьких баночек с ростками новой жизни в «софитах» светодиодных ламп. Это будущие саженцы ежевики, малины, земляники садовой, которые выращивают in vitro (в стекле). Они только пробились из специальной среды, сваренной агрономами, по виду похожей на мармелад. Несмотря на миниатюрные размеры, саженцы полны сил, с отличным иммунитетом, без вирусов и бактерий. О таком посадочном материале украинские сельхозпроизводители могут не только помечтать, но и приобрести его. В Украине работает уже несколько лабораторий микроклонального размножения растений in vitro. Одна из них в фермерском хозяйстве «Агролайф» в Николаеве.
«Агролайф» более десяти лет культивирует овощи и фрукты в Витовском районе Николаевской области. Овощи борщевого набора не приносили ожидаемых доходов, а цифры финансового отчета в конце каждого сезона подталкивали к поиску новых культур, новых технологий. Так и появилась лаборатория in vitro. История работы «Агролайфа», кроме прочего, еще одна иллюстрация к бестселлеру об ореховом производстве в Украине.
«Мы изначально занимались выращиваем овощей, но холдинги, крупные плодоовощные компании постепенно вытесняют мелких производителей овощей борщевого набора, — рассказывает Владимир Хомут, глава фермерского хозяйства «Агролайф». – Возникла идея посадить ореховый сад. Орехи – продукт с высокой стоимостью и пользующийся спросом на внутреннем и внешнем рынках сбыта. Условно добротные саженцы орехов из Молдовы, Франции и Испании стоили дорого, 10-20 евро, и не имели гарантии качества. Во время выращивания оказалось, что много саженцев поражено бактериальными болезнями. Мало того, что дорого купили, еще и лечить надо».
В поисках саженцев высокого качества появилась идея создания собственной лаборатории микроклонального размножения растений in vitro. Успешная практика выращивания орехов по такой технологии существует в Соединенных Штатах Америки и Иране, первые успехи отмечают турецкие агрономы. Микроклональный метод размножения позволяет круглогодично и за короткий промежуток времени получать десятки и сотни тысяч здоровых растений из одной лишь почки. Это преимущество все больше привлекает украинских сельхозпроизводителей.
Компания «Агролайф» арендовала помещение вафельного цеха, переоборудовала его под лабораторию in vitro. У агронома фермерского хозяйства Дмитрия Киселева был опыт выращивания саженцев из почки в пробирке и налаженные контакты с профессиональными специалистами в этой отрасли, под их чутким руководством и начала работу лаборатория. Полтора года экспериментировали с почками ореха грецкого. Перепробовали все возможные химические составы для обработки почек, все описанные и неописанные рецепты среды для выращивания саженцев. Размножить орех грецкий удалось, а вот укоренить – все не получалось.
Упорство привело представителей хозяйства в Калифорнию, где перенимали опыт у лучших специалистов. Американцы ничего не скрывали, предоставили презентацию с подробным описанием процессов, но заокеанский рецепт не принес успеха. «Агролайф» вел переговоры с иранскими производителями саженцев ореха грецкого in vitro о покупке технологии. Восточные партнеры запросили 100 тысяч долларов за протокол, а нужно было два – протокол на размножение и протокол на укоренение.
Владимир Хомут уверен, что ореховую вершину им еще предстоит покорить, от этой темы их хозяйство отступаться не намерено. Работают: изучают, «химичат», готовят растворы, экспериментируют.
Ягодный инкубатор
Параллельно с орехом грецким в лаборатории занимались и другими культурами: ежевикой, малиной, земляникой садовой (клубникой), подвоем черешни, жимолостью, лавандой. Уже есть свои наработки, успехи. Сейчас в лаборатории «укрощают» шалфей. Это привередливое растение дало ростки в питательной среде, но с укоренением не спешит.
Тысячи саженцев из лаборатории in vitro высажены на полях «Агролайфа», не доставляют хлопот, потому что не болеют, прекрасно плодоносят. Саженцы «Агролайфа» пользуются спросом у производителей ягод, их приобретают тысячами для закладки новых плантаций.
Владимир Хомут говорит, что технология микроклонального размножения растений in vitro имеет два неоспоримых преимущества – это скорость получения однородной продукции и качество посадочного материала.
In vitro -в переводе с латинского означает «в стекле», то есть растения выращивают в пробирках. Метод in vitro гарантирует высокий индекс размножения, что позволяет оперативно получить новые сорта растений для производства. Технология не требует большого количества материала для начала работ и позволяет размножать растения, которые относятся к трудно размножаемым в природных условиях. Лаборатория in vitro работает круглый год, не зависит от погодных условий за окном, а главное – в процессе размножения посадочный материал оздоравливается.
Кухня in vitro
В лаборатории in vitro стерильно, как в операционной. На полках выстроены тысячи пустых баночек, этаких инкубаторов, после стерилизации они ждут своего часа. В шкафах — емкости с химическими веществами. На стенах кухни — протоколы подготовки питательной среды для размножения и укоренения растений. Для каждой культуры свой рецепт.
«Лаборатория начинается с кухни. Здесь мы варим питательную среду, в которую потом высаживаем экспланты — части растений, культивируемые в условиях in vitro, для каждого растения свой рецепт среды. В ее составе микроэлементы, макроэлементы, аскорбиновая кислота, глицин, витамины, сахар. Химический состав подбирается под каждую культуру индивидуально, — рассказывает лаборант Варвара Пилипенко и просит не фотографировать рецепты. Секрет фирмы! — Питательная среда разливается по стерилизованным банкам, банки со средой автоклавируются, затем в стерильных условиях происходит высаживание почек в среду».
Почку растения перед посадкой обрабатывают специальными растворами для подавления всех бактерий и грибков. Нужно убить все патологические организмы, не убив растение. Работы проводятся в ламинарном шкафу, где создана сверхчистая среда необходимая для манипуляций с биологическими продуктами. Ламинарный бокс оснащен принудительной вентиляцией, которая обеспечивает движение чистого воздуха через специальные фильтры, а также специальными лампами и ультрафиолетовым освещением. После очистки воздух поступает внутрь шкафа равномерным ламинарным потоком, который защищает биопродукт от контакта с окружающей средой. Перед работой с почкой стол ламинарного шкафа обеззараживают, обжигая его поверхность с помощью спирта и огня. Почку делят и вводят в специальную среду, приготовленную на основе агар-агара, которая напоминает мармелад. Можно ввести тысячу почек, из них только пять прорастут, потому что будут стерильными. Остальные обрастают грибками.
«Самое сложное в технологии микроклонального размножения растений in vitro – не заразить растение, когда разрезаешь почку. Одна ошибка – и придется культуру вводить заново. Если в первую неделю после высадки грибок не появился, то шансы погибнуть у растения минимальны», — рассказывает лаборант Сергей Бондарев.
Почка растет и размножается при определенном температурном и световом режиме, заданных параметрах влажности. Через два месяца в пробирке появляется пушистый кустик. На втором этапе кустик разрезают на несколько частей и высаживают их в совершенно другую по химическому составу питательную среду для укоренения. На укоренение нужен еще месяц — два. Это зависит от культуры. Когда корешки вырастают, растения выносят в климатические столы для адаптации – in vivo. Саженцы «гнездят» в кассеты с чистым торфом. Здесь растение набирается сил еще около трех месяцев. Путь от почки до готового саженца длится около полугодия.
Полученный из пробирки посадочный материал в полевых условиях показывает отличный результат. Саженцы in vitro гарантировано оздоровлены, имеют сильный иммунитет и практически не нуждаются в обработке средствами защиты растений. Внедрение новой технологии позволяет обеспечить качество посадочного материала и значительно сократить затраты на производстве культур.
На орехах – не на бобах!
Менеджер по развитию плодоовощного рынка Украинского проекта бизнес-развития плодоовощеводства (UHВDP) Сергей Потапов считает, что орех – не культура, это целая религия. Из поколения в поколение передается вера в то, что следующая «смена» заработает огромные деньги на ореховом бизнесе. Самые разные люди бросаются с головой в ореховый бизнес, несмотря на определенные сложности, верят в успех своего предприятия. Да, действительно, орех – высокобелковый, полезный продукт, вкусный и востребованный, успешно экспортируется. Но есть и обратная сторона… скорлупы.
«За последние 15 лет в ореховом бизнесе прибыль, как правило, получают те, кто выращивают саженцы. Потому что за это время саженцы еще не вышли на свою урожайность, около 50 процентов посадочного материала погибло по тем или иным причинам. Хороших садов с высокой урожайностью в Украине сейчас нет. Они растут, но медленно. Даже до уровня Молдовы мы пока не поднялись ни по количеству, ни по качеству. Как было все на уровне скупки у населения, так и осталось. Осенью повсюду стоят объявления: «Куплю орех», — говорит Сергей Потапов.
В Украине до сих пор нет ни одного успешного примера хозяйства, занимающегося производством ореха высокого качества в промышленных объемах. Ореховый бизнес, как был любительским, так им и остался, фермеры продолжают собирать небольшие партии ореха за наличные по городам и весям.
До 70 процентов ореховых саженцев не могут акклиматизироваться, не приживаются, не выживают, требуют пересаживания. Поэтому бизнес в основном вращается вокруг сбыта саженцев, а не готовой продукции.
Сергей Потапов, заглядывая вперед, прогнозирует, что в Украине появятся крупные богатые предприятия по производству орехов:
«Умных, правильно вкладывающих деньги становится больше, аматоров меньше. Если в Украине смогут вырастить саженцы орехов in vitro, производители получат гарантировано качественный посадочный материал вместо сегодняшнего кота в мешке. Хороший старт – половина успеха».
А чтобы поклонники ореховой темы не расслаблялись, скажем, что фермерское хозяйство «Агролайф» в сотрудничестве с одесским кооперативом «Орех Причерноморья» весной 2017 года приступило к экспериментальному выращиванию саженцев фундука in vitro. Ждем!
Риза – микориза
В Белявском районе Одесской области расположен единственный в Украине сад совместного выращивания грецкого ореха, фундука и трюфеля. С 2012 года кооператив «Орех Причерноморья» заложил уже 150 гектаров сада и собственный питомник ореха грецкого и фундука.
«Мы хотим максимально удешевить производство саженцев и дальше развиваться по принципу кооператива, давать в кредит саженцы тем, кто хочет выращивать орех и фундук по нашей технологии, — говорит руководитель кооператива «Орех Причерноморья» Павел Тулба. — Чтобы производители могли развиваться, мы готовы приобретать полученный урожай для последующей доработки и реализации оптовыми партиями».
Кроме того, Павел Тулба отмечает, что стоимость саженцев привитого ореха почти в 3 раза выше стоимости сеянца, сеянцы грецкого ореха дешевле и в уходе в период роста дерева до плодоношения. Это существенный аргумент за при создании сада для бизнеса. «Орех Причерноморья» заложил сад на 100 лет из орехов проверенных сортов украинской селекции: Буковинская бомба-1, Буковинская бомба-2, Черновицкий, Буковинский. Выбранные сорта отлично подходят для механизированного раскола скорлупы, что немаловажно при формировании цены на готовый продукт.
В «Орехе Причерноморья» грецкий орех и фундук размножают при помощи одревесневших черенков деревьев. Все растения обязательно микоризируют. Микориза – это гриб, который существует в симбиозе с растением, это и мощный «насос» для растений. Микориза не только подаёт им воду из глубинных слоев почвы, но и питает. С помощью микоризы орехи из почвы впитывают и усваивают макро- и микроэлементы. Микориза обеспечивает быстрое развитие растения. И грецкий орех, и фундук без микоризы не начинают расти в отличие, скажем, от яблони.
«В нашем саду заложен маточник для выращивания саженцев фундука и налажено производство саженцев из отводок, одревесневших черенков, зеленых черенков, полученных от материнских растений фундука, растущих в нашем саду. По всем сортам фундука, растущим в нашем саду, мы бесплатно даем консультации по выращиванию и уходу», — рассказывает Павел Тулба.
Сейчас в «Орехе Причерноморья» заготовлено 20 тысяч одревесневших черенков, с помощью корнезакрепителя агрономы формируют корни растений.
«Мы готовим качественные саженцы со сформированной корневой системой. Участок в 1 га для укоренения орехов закрыт агроволокном и навесом из затеняющей сетки, здесь же расположены система капельное орошения и туманные установки. В таких условиях орехи хорошо приживаются и не подвержены заболеваниям», — говорит руководитель кооператива.
Задача «Ореха Причерноморья» № 1: выяснить, как дешевле получить качественные саженцы — черенкованием или in vitro. Впрочем, Павел Тулба считает, что с появлением нового рынка саженцев – качественных, с высокой урожайностью, украинские орехи прыгнут в цене не выше молдавских или на их уровень.
Мировые цены на орех грецкий формирует Китай, являющийся самым крупным потребителем средне- и низкосортного продукта, из которого изготавливается популярное в Китае ореховое молоко. Грецкие орехи высшего качества, отличающиеся высоким содержанием масла и крупным размером ядра, родом из США, Чили и Франции. Если Украина займет нишу между ведущими странами-производителями орехов и Молдовой, это будет отличный экономический результат. Есть одно «но», нужно потрудиться над созданием бренда нового украинского ореха. Пока же репутация нашего орехового продукта не способствует его популярности.
Операция «Кооперация»
Кооператив «Орех Причерноморья» создан для развития сети единомышленников, готовых выращивать фундук и грецкий орех по предложенной модели. Для оптовой торговли очень важно с определенной периодичностью формировать оптовые партии однородной продукции высокого качества. Такую задачу проще решить сообща. Кооперация производителей той или иной продукции – это отличная мировая практика, которая демонстрирует успехи в бизнесе. Павел Тулба считает, что кооперация на внутреннем рынке и объединение мелких и средних производителей вокруг лидера – это целесообразно и выгодно всем.
«Мы проектируем переработку фундука в готовый продукт. Фундук в кусте не созревает. Ферментация фундука происходит после уборки, его масличность и вкус формируются во время сушки. Мы планируем передавать саженцы будущим членам нашего кооператива, чтобы они выращивали фундук на своей земле и передавали нам на переработку», — объяснил Павел Тулба.
Но, даже с учетом кооперации, выйти на мировой рынок украинскому производителю проще, если обратить взор на производство органических орехов. На сегодняшний день «Орех Причерноморья» приступил к первому этапу сертификации как органического производителя.
«Кооперация для выращивания/производства орехов (в частности грецких) – обычный и достаточно эффективный путь в этом бизнес. Ферментация (подготовка) орехового сырья, сушка, раскалывание, калибровка, выбраковка, упаковка – это процессы, требующие механизации и одинаковых подходов, в результате которых получается однородное по составу сырье, — говорит Сергей Потапов. — Кооперация является хорошей мировой практикой, позволяющей управлять бизнесом, который приносит прибыль».
Наталья Рубан специально для журнала «Агроиндустрия» (статья опубликована в майском выпуске)
Множество писем по поводу возможности клонирования в квартирных условиях заставили меня написать эту статью.
Да, теоретически это возможно.
(Мы, конечно же, имеем для этого спецоборудование.)
Данная статья рассчитана на простых людей, не имеющих спецобразования,
поэтому писать буду простым языком, без применения специальных терминов.
Научных работников лабораторий по размножению in vitro прошу отнестись к ней лояльно.
Прежде всего, разберемся во всех плюсах и минусах микроклонального размножения.
Минусы:
Качественный процесс, если соблюдать все правила, - очень дорогое удовольствие.
Поэтому, выгодно это только в очень большом количестве - десятки тысяч и более.
Мало кто в нашей стране в это хочет вкладывать десятки тысяч долларов.
Именно поэтому, мы имеем дело часто с некачественным посадочным
материалом. Растения плохо переносят адаптацию, химеры спортуют, и т.д.
При размножении же традиционным способом, слабые растения просто
погибают, а выживают сильнейшие.
Плюсы:
При соблюдении всех
тонкостей, при микроклональном размножении можно получать любое
количество одинаково очень качественного посадочного материала, что не
возможно при традиционном размножении. В дальнейшем после адаптации,
качественно клонированные растения опережают в своем развитии своих
братьев, выращенных традиционным способом.
Если у Вас есть
свободное время и желание попробовать, то я опишу первый, на мой
взгляд, самый главный этап этого процесса. Клонировать будем
фаленопсис. Так как питательная среда содержит все необходимое для
размножения не только нужной для нас культуры, но и для всевозможных
грибков, бактерий, летающих в воздухе и находящихся на самом растении,
нужно пройти этап получения стерильной культуры.
Как только Вы получите стерильный, жизнеспособный материал, дальше множить его - дело техники.
Для начала, Вы должны найти подходящее помещение. Например, подойдет
ванная комната, облицованная кафельной плиткой. Моете ее всю с
применением дезинфицирующего средства. Предварительно покупаете в
медтехнике кварцевую лампу 400вт.(50-100гривен), подключаете ее к
обыкновенному дросселю(40-80грн.) Кварцуете комнату 2- 4 часа.
Покупаете ватно-марлевую повязку, халат, шапочку. Проглаживаете все эти
вещи и вешаете в комнате перед кварцеванием. Все вспомогательные вещи,
кроме, конечно, растений, заносятся в комнату перед кварцеванием. Любая
малейшая пылинка, попавшая в стерильную пробирку с питательной смесью,
вырастет в большую плесень. Поэтому хочу обратить Ваше внимание на
ответственность этого этапа. Естественно, нужно заклеить все
вентиляционные отверстия. Далее Вам понадобятся пинцет, скальпель,
стерильные салфетки (их должно быть не менее 10), на которых вы будете
подрезать цветоносы. Пустые банки, фольга, инструменты стерилизуются в
духовке при температуре не ниже 200 градусов 2 часа. В качестве
салфеток подойдут льняные лоскутки размером 20 на 20 см. Заворачиваете
в пищевую фольгу, все по отдельности, и прожигаете в духовке при
температуре 150 градусов 3 часа (подберите сами максимальную
температуру, чтобы они не сгорели).
Покупаете в аптеке
дистиллированную воду, разливаете в предварительно стерилизованные в
духовке 200 граммовые банки. Закрываете банки прожженной фольгой и
стерилизуете, можно в духовке, скороварке, микроволновке (фольгу
заменить бумагой). Далее готовите стерилизационный раствор. Подойдет
обыкновенная хлорка. Разводите ее 10гр на 100 мл дистиллированной воды.
Моете цветоносы в проточной воде с хозяйственным мылом.
Вот минимум предварительных работ.
Выключаете
кварцевую лампу (обгореть можно за 10 минут), заходите в комнату,
заносите цветоносы, переодеваетесь (надеваете халат, шапочку,
ватно-марлевую повязку), протираете руки и стол, на котором будете
работать, спиртом. Никаких резких движений.
Расставляете перед собой
банку со стерилизующим раствором и три банки со стерилизованным
дистиллятом. Опускаете цветоносы в первую банку. Вынимаете стерильным
пинцетом первый цветонос через 6 минут, второй через 8 и т.д.,
последний через 20 минут. Опускаете сразу после первой банки в
дистиллят. Вымачиваете цветоносы 10 минут. Пинцет и скальпель
стерилизуете в пламени спиртовки и даете им остыть перед каждым
последующем использованием. Опускаете цветоносы в следующую банку с
дистиллятом. Затем, также в третью. Это необходимо для удаления
остатков хлорки. Разворачиваете фольгу с салфетками и кладете на нее
один цветонос. Обрезаете цветонос прожженным скальпелем. Оставляете
внизу под спящей почкой 5мм., выше - 3 мм. Открываете пробирку с
питательной смесью (покупаете у меня - 2 гривны штука), сажаете туда
цветонос, чтобы спящие почки были над поверхностью, закрываете фольгой.
И так далее с каждым цветоносом, меняя салфетки и стерилизуя
инструменты. ВСЕ.
Ставите пробирки с цветоносами на полки.
Температура 25-28 градусов. Продолжительность светового дня примерно 16
часов. Влажность 70%. Если в пробирках через две недели не поросло
плесенью, то Вы достерилизовали. Если через месяц (максимум 1,5 месяца)
почки не проснулись, то Вы перестерилизовали. Из спящих почек, при
соблюдении температурного режима, вырастут несколько маленьких розеток,
которые в дальнейшем Вы и будете клонировать.
Ну как, Вам еще хочется попробовать этим заняться?
Если Вы осилите этот этап, то следующие тем более.
В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.
Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т.д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т.д.). Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстроувеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М. Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).
Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.
Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологичеки активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов – эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов.
Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.
Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.
Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro. Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления.
Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей–использование ее в клеточной селекции.
Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны. Иногда, например, при селекции гречихи, трудно воспроизвести в потомстве уникальные генотипы из-за перекрестного опыления культуры. Поэтому перед исследователями часто встает задача – размножить и сохранить полученные растения. В этом помогает метод клонального микроразмножения. Размножают гибриды путем активации развития меристемы пазушных почек (черенкованием стерильных побегов), адвентивными почками или регенерацией растений из каллусной ткани, в частности полученной при культивировании зародышей.
Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.
В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллельных гена в гомологичных хромосомах. Особь обычно гетерозиготна (два гена различаются), при этом проявляется действие только доминантного (но не рецессивного) гена. Поскольку мутации чаще рецессивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомологичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доминантных, но и рецессивных признаков.
Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные гомозиготные растения.
Гаплоиды могут возникать спонтанно, но частота их спонтанного возникновения очень мала. Искусственным путем с Использованием методов in vitro удается получить большие количества гаплоидных растений. Существует три способа получения гаплоидов с использованием метода культуры изолированных тканей:
андрогенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор.
гиногенез – получение гаплоидных растений на искусственной питательной среде из изолированных семяпочек;
партеногенез – получение гаплоидов из гибридного зародыша, у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны отцовские хромосомы.
Образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского генома гаплоидные эмбриоиды культивируют на искусственных питательных средах и получают гаплоидные растения. Сорта ячменя Исток и Одесская-15 были получены комбинацией партеногенетического метода с культурой изолированных зародышей за четыре года вместо обычных 10–12 лет. Методом культуры пыльников из сортов и гибридов мягкой и твердой пшеницы в НПО «Элита Поволжья» за четыре года получено более 2,5 тыс. дигаплоидных линий, которые характеризуются гомогенностью и стабильностью.
Продолжается разработка технологии получения гаплоидов посредством культуры пыльников пшеницы, ячменя, кукурузы, озимой ржи, картофеля. В культуре пыльников возможны два пути образования гаплоидных растений. Первый – образование растений путем эмбриогенеза в пыльцевых зернах. При этом внутри пыльников из отдельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и дают гаплоидные растения. Второй – образование каллуса из клеток пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных клеток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности. До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных гаплоидных клеток или от слившихся клеток.
Гаплоиды, полученные in vitro, могут применяться не только в практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а также по клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некоторых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для опытов по генетической трансформации.
Криосохранение растений
Криосохранение соматических клеток растений в жидком азоте (температура – 196° С) – новое направление в биотехнологии, которое широко стало развиваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии заключается в сохранении в культуре in vitro генофонда, а также в обеспечении селекционеров в любое время генотипом, имеющим искомые признаки: необходимая пыльца для проведения гибридизации; уникальные и единичные семена, в том числе не выносящие обезвоживания; трансформированные, мутантные, гибридные клетки разных видов растений, способных к морфогенезу in vitro; зиготические и соматические зародыши и т.д. В настоящее время разработаны условия криосохранения для культивируемых клеток более 30 видов, каллусных культур (около 10 видов), изолированных протопластов (8 видов), сохранения меристем (25 видов) и кончиков стебля (13 видов). Приоритет в этом направлении принадлежит Институту физиологии растений РАН и, в частности, отделу культуры тканей и морфогенеза, возглавляемому проф. Р. Г. Бутенко.
При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде всего, учитывать специфику растительных клеток: отбирать мелкие клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды; разрабатывать в каждом отдельном случае подходы замораживания и последующего оттаивания растительных клеток. При криосохранении встречается ряд трудностей, одна из которых связана с защитой замораживаемых клеток и тканей от осмотического стресса и механического разрушения структур в результате образования и роста кристаллов льда внутри клетки. Одновременно с этим необходимо правильно подбирать условия, обеспечивающие высокую выживаемость клеток при оттаивании и рекультивации.
Несмотря на многообразие работ в этом направлении, в них все же наметились общие приемы, лежащие в основе криосохранения: обработка клеток перед замораживанием, применение криопротекторов, соблюдение определенного режима замораживания в интервале от 0 до –40° С (в редких случаях до -70° С), а также специальные предосторожности при оттаивании объектов.
Процесс криоконсервации, как правило, начинается с подготовки культуры клеток к замораживанию. Это может быть достигнуто несколькими способами, предусматривающими культивирование клеток на питательных средах, содержащих различные осмотически активные вещества: маннит или сорбит в концентрации 2–6%, аминокислоты и среди них, в первую очередь, пролин, чье значение для связывания воды в клетках растений широко известно, а также у-аминомасляная кислота.
Подбор криопротекторов, веществ, уменьшающих повреждение клеток от осмотического и механического стресса, проводят эмпирически по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Среди всех известных криопротекторов выделяются такие легко проникающие в клетки вещества, как диметилсульфоксид (ДМСО, 5–10%), глицерин (10–20%), а также непроникающие высокомолекулярные–поливинилпиролидон (ПВП), декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000.
Большое значение при криосохранении имеет правильно подобранный режим замораживания от 0 до –40° С. Как правило, для всех объектов устанавливается скорость замораживания 0,5–1 °С в минуту и всю эту работу проводят на специальном оборудовании, обеспечивающем программное замораживание. Такие приборы выпускает специальное конструкторское технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины (г. Харьков).
Таким образом, медленное замораживание и использование криопротекторов позволяет освободить клетку от свободной воды, и при –40° С клетки становятся полностью обезвоженными, что дает возможность проводить дальнейшее замораживание, а именно погружать ампулы с растительным материалом в жидкий азот.
Хранение материала в жидком азоте практически не лимитировано. Например, в криобанке Института физиологии растений РАН хранятся клетки моркови, которые находятся в жидком азоте около 20 лет, меристемы картофеля – более 10 лет и др.
Оттаивание и проверка жизнеспособности клеток после хранения в жидком азоте является последним этапом технологии криосохранения. Если замораживание осуществляют медленно, постепенно, то оттаивание должно быть проведено как можно быстрее. Для этого ампулы помещают в водяную баню с температурой 40°, а иногда и 60° С и выдерживают до полного исчезновения последнего кристаллика льда.
Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания применяют наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ – окраска витальным красителем (0,1%-ным феносафранином или 0,25%-ным раствором сини Эванса), в результате которой мертвые клетки окрашиваются, а живые нет. Окончательным критерием, безусловно, служит четкое возобновление роста и деления клеток при рекультивации на искусственных питательных средах после оттаивания.
Экспериментально было показано, что клетки после хранения в жидком азоте не теряют способности к делению, регенерации растений, не уменьшается продуктивность синтеза вторичных метаболитов (клетки продуценты) и т.д. Так, Институтом физиологии растений РАН совместно с НПО по картофелеводству разработаны методы криосохранения меристем четырех сортов картофеля и показана возможность из 20% хранящихся меристем регенерировать целые растения, которые при высадке в поле не отличались по всем признакам, включая темпы роста и продуктивность, от обычных пробирочных растений (С. Манжулин и др., 1982). Более подробно о технике криосохранения можно узнать из обзорных работ А. С. Попова.
Таким образом, технология, связанная с криосохранением растительных объектов, развивается и постоянно совершенствуется. Несомненно, эта технология имеет свое будущее, так как уже сегодня криобанки могут значительно облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов, в том числе старой селекции и диких видов, а также исчезающих видов растений.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к способу выращивания растений in vitro. Способ состоит в том, что приготавливают питательную среду для укоренения, в качестве которой используют питательную среду по Мурасиге и Скугу, разбавленную вдвое по минеральным и органическим компонентам. В указанную среду добавляют оксибензойную кислоту в концентрации 110 -5 - l10 -4 M. Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают pH 5,5 - 5,7 и при нагревании растворяют навеску агар-агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм (температура 120°С) в течение 15 - 20 мин, после чего осуществляют высадку на нее побегов. Через 30 дней культивирования на питательной среде укоренения пробирочные растения высаживают в нестерильные условия. При этом растения извлекают из сосудов и обрабатывают борной кислотой в концентрации 1,510 -4 - 1,510 -3 М. Способ позволяет увеличить приживаемость растений при пересадке в нестерильные условия на 13,3 - 49,0% по сравнению с известным способом адаптации. Технический результат достигается тем, что последовательно воздействуют оксибензойной кислотой на этапе укоренения побегов, а затем борной кислотой перед пересадкой растений в нестерильные условия. 2 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в процессе укоренения и адаптации различных культур. Известен способ выращивания растений in vitro, при котором в питательную среду для укоренения с целью улучшения ризогенеза вводят регулятор роста ауксиновой природы, причем в качестве последнего чаще всего используют индолилмасляную кислоту /авт.св. СССР N 1792270, кл. A 01 H 4/00, 29.04.91. Пивень Н. М., Мельничук Г.Г., Фелалиев А.С. Способ укоренения побегов орехоплодных, полученных in vitro. Бюл. N 4 от 30.01.93/. Однако при таком способе на начальном этапе укоренения часто наблюдается усиление недифференцированного роста тканей, ингибирование процессов формирования и роста корней, что приводит к ухудшению укореняемости и удлинению периода укоренения растений. Поэтому для улучшения укореняемости применяют различные приемы, например, замачивают микрочеренки в растворе регулятора роста /ИМК/ над поверхностью агаризованной среды /патент РФ N2060646 кл. A 01 H 4/00, 1994 г. Туровская Н. И., Пронина И.Н., Матушкина О.В. Способ укоренения побегов плодовых культур, полученных in vitro. Бюл. N 15 от 27.05.96/. Вместе с тем данный способ весьма трудоемок, требует дополнительных затрат времени на приготовление среды и создает опасность контаминации среды вредной микрофлорой. Критическим этапом для растений, выращенных на питательных средах, является их адаптация к нестерильным условиям. При этом иногда погибает более 50% высаженных растений. Для улучшения приживаемости растения намачивают в воде /авт.св. СССР N 1720597, кл. A 01 H 5/00, 26.12.89. Упадышев М.Т., Высоцкий В. А. Способ подготовки растений - регенерантов к посадке в нестерильные условия. Бюл. N 11 от 23.03.92/. Однако намачивание в воде не на всех культурах приводит к положительным результатам. К тому же в условиях повышенной влажности воздуха и субстрата для адаптации создаются предпосылки поражения растений грибной инфекцией. Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ адаптации растений к нестерильным условиям, при котором растения с целью улучшения приживаемости обрабатывают 1%-ным раствором марганцевокислого калия, а затем раствором индолилуксусной кислоты /патент N 1792269 кл. A 01 H 4/00, 03.01.90. Дорошенко Н.Н., Кострикин И.А. Способ адаптации растений к нестерильным условиям. Бюл. N 4 от 30.01.93/. Недостатками этого способа являются многооперационность, трудоемкость, а также то, что он апробирован только на растениях винограда. Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является увеличение укореняемости побегов, улучшение развития корневой системы различных растений, увеличение приживаемости пробирочных растений при пересадке в нестерильные условия, ускорение и упрощение процесса выращивания. Поставленная задача решается тем, что в способе выращивания растений in vitro, включающем приготовление питательной среды, высадку на нее побегов растений и их культивирование, на этапе укоренения растений в питательную среду дополнительно вводят оксибензойную кислоту в концентрации 110 -5 -110 -4 М. Кроме того, задача решается и тем, что на этапе пересадки в нестерильные условия растения обрабатывают антисептиком, в качестве которого используют борную кислоту в концентрации 1,510 -4 -1,510 -3 М. Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что растения на этапе адаптации обрабатывают в качестве антисептика борной кислотой, причем предварительно растения культивируют на среде укоренения с добавлением оксибензойной кислоты. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "новизна". Предложенное техническое решение обладает изобретательским уровнем, так как предложенный способ выращивания совершенно неочевиден для специалистов, работающих в области культуры ткани, и ранее не был использован для этих целей, то есть предложен впервые. Применение предлагаемого способа позволяет получить новый эффект - увеличить укореняемость побегов, улучшить развитие корневой системы растений, повысить их приживаемость в нестерильных условиях. Химические препараты, необходимые для осуществления предложенного способа выращивания, характеризуются низкой стоимостью и производятся промышленностью, поэтому изобретение вполне может быть реализовано в условиях учреждений, работающих в области культуры тканей и органов растений. При этом не требуется разработки специального оборудования. Пример 1. Приготавливают питательную среду для укоренения. Для этого берут питательную среду по Мурасиге и Скугу /1962/, разбавленную вдвое по минеральным и органическим компонентам, мг/л: аммоний азотнокислый - 825, калий азотнокислый - 950, кальций хлористый - 220, магний сернокислый - 185, калий фосфорнокислый - 85, железо сернокислое - 13,6, этилендиаминотетраацетат натрия - 18,7, борная кислота - 3,1, марганец сернокислый - 11,2, цинк сернокислый - 4,3, калий йодистый - 0,42, натрий молибденовокислый - 0,13, медь сернокислая - 0,013, кобальт хлористый - 0,013, миоинозит - 50,0, тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота - по 0,25, аскорбиновая кислота - 0,5, индолилмасляная кислота - 1,0, сахароза - 15000, агар - агар - 7000, остальное - вода до 1 л. В указанную среду добавляют оксибензойную кислоту в концентрации 110 -5 М. Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают pH 5,5-5,7 и при нагревании растворяют навеску агар-агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм /температура 120 o C/ в течение 15 - 20 мин, после чего осуществляют высадку побегов. Как показали результаты /табл.1/, при разработанном способе отмечается увеличение укореняемости в зависимости от вида растения на 7 - 15%, числа корней в 1,2 - 2,8 раза, длины корней в 1,7 - 3,2 раза по сравнению с прототипом. Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1. В питательную среду вводят оксибензойную кислоту в концентрации 5,010 -5 М>. Как видно из таблицы 1, применение разработанного способа выращивания позволяет увеличить укореняемость побегов в среднем на 20 - 27%, числа корней - в 2,1 - 2,9 раза, а их длины - в 1,8 - 5,6 раза по сравнению с известным способом. Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, в питательную среду вводят оксибензойную кислоту в концентрации 1,010 -4 М. Предложенный способ обеспечивает увеличение укореняемости побегов на 15 - 67%, числа корней - в 2,1 - 3,3 раза, длины корней - в 2,1 - 5,0 раз в сравнении с прототипом /табл. 1/. Следует отметить и такой положительный эффект выращивания растений по предложенному способу, как снижение диаметра каллуса в среднем в 1,6 раза по сравнению с известным способом. Это особенно важно для такой культуры, как груша, поскольку на среде с одной индолилмасляной кислотой она формирует в основании побега очень большой каллус, что отрицательно сказывается и на укоренении, и на развитии корневой системы. Более низкие концентрации оксибензойной кислоты /0,510 -5 М/ или более высокие концентрации /2,010 -4 М/ ухудшали развитие растений по сравнению с предложенным диапазоном концентраций, а следовательно, были менее эффективными /табл. 1/. Пример 4. Пробирочные растения через 30 дней культивирования на питательной среде укоренения высаживают в нестерильные условия. При этом растения извлекают из сосудов и обрабатывают борной кислотой в концентрации 1,510 -4 -1,510 -3 М. Приживаемость растений, обработанных борной кислотой, возрастает на 25,9-49,0% для груши, 14,3-35,7% для ежевики, 13,3-20,0% для малины черной, 16,7-40,0% для малино-ежевичного гибрида и на 10% для жимолости по сравнению с известным способом адаптации /табл. 2/. Часто наряду с увеличением приживаемости улучшается развитие корневой и надземной систем растений, увеличивается число листьев. Полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известным способом выращивания. Применение оксибензойной кислоты на этапе укоренения позволяет в среднем увеличить процент укоренения в 1,5 раза, число корней - в 2,3 раза, длину корней - в 3,3 раза. Благодаря более раннему укоренению растения становятся пригодными к высадке в нестерильные условия на 7 - 14 дней раньше, а следовательно, и ускоряется технологический цикл выращивания. Обработка растений борной кислотой на этапе адаптации к нестерильным условиям способствует увеличению приживаемости растений в среднем на 24% по сравнению с известным способом. В лучших вариантах число корней возрастало в 2 раза, их длина - в 5,6 раза, приживаемость в нестерильных условиях - в 4,4 раза. Выход готовых растений в среднем увеличивался в 1,9 раза по сравнению с известным способом выращивания.
Формула изобретения
Способ выращивания растений in vitro, включающий приготовление питательной среды, содержащей оксибензойную кислоту, высадку на нее побегов растений и их культивирование для укоренения с последующей пересадкой растений в нестерильные условия, отличающийся тем, что перед пересадкой в нестерильные условия их обрабатывают борной кислотой в концентрации 1,5 10 -4 - 1,5 10 -3 М.